邢寶玲，郭存存，唐正華，董一善，葛素梅

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市婦幼保健院1.病理科，2.婦科，江蘇 常州 213003）

卵巢癌是死亡率最高的婦科腫瘤，＞75%卵巢癌發(fā)現(xiàn)時(shí)已是進(jìn)展期，腹腔液中是否有癌細(xì)胞對判斷卵巢癌分期﹑制定治療方案及監(jiān)測復(fù)發(fā)有重要價(jià)值[1-2]。目前，檢測腹水中惡性細(xì)胞主要依靠光鏡下的細(xì)胞識(shí)別和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，當(dāng)細(xì)胞量少時(shí)，易出現(xiàn)漏診或過診斷，而且不能分離癌細(xì)胞，以檢測生物學(xué)特性[3]。本研究采用磁激活細(xì)胞分選法（magnetic activated cell sorting, MACS）富集腹水中的卵巢癌細(xì)胞，用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法（Immunocytochemistry, ICC）聯(lián)合熒光原位雜交法（fluorescence in situ hybridization, FISH）識(shí)別癌細(xì)胞，旨在探討新方法對精準(zhǔn)分離惡性腹水中癌細(xì)胞的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

10%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）（美國Gibco公司），RPMI 1640（美國Hyclone公司），CD326磁珠分選試劑盒（德國美天旎公司），EpCAM熒光抗體（EBA-1）（美國BD公司），8號(hào)染色體探針（chromosome enumeration probe 8, CEP8）（美國雅培公司），線粒體綠色熒光探針（Mito-Tracker Green）（英國Shandon公司），卵巢癌SKOV3細(xì)胞（上海諾辰生物公司），7周齡雌性BALB/c裸鼠（常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

細(xì)胞培養(yǎng)箱（英國Thermo公司），光學(xué)顯微鏡XDS-1A（上海精美儀器公司），倒置顯微鏡IX71（日本Olympus公司），低速離心機(jī)TDZ4B-WS（上海盧湘儀離心機(jī)儀器公司），共聚焦顯微鏡（德國Leica公司）。

1.3 體外卵巢癌腹水模型的復(fù)制

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) SKOV3細(xì)胞在含有10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，37℃﹑5%二氧化碳CO2的飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 Mito-Tracker Green標(biāo)記SKOV3細(xì)胞 用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋Mito-Tracker Green至終濃度為100 nmol/L，加入培養(yǎng)的細(xì)胞中，37℃條件下孵育45min，形成Mito-Tracker-Green-SKOV3細(xì)胞，去除Mito-Tracker Green染色工作液，加入37℃預(yù)溫育的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液。

1.3.3 體外卵巢癌腹水模型 收集江蘇省常州市婦幼保健院子宮平滑肌瘤患者的腹腔沖洗液，將Mito-Tracker-Green-SKOV3細(xì)胞濃度調(diào)整為1×104個(gè)/ml，取100μl細(xì)胞懸液加入96孔板，經(jīng)反復(fù)稀釋并計(jì)數(shù)后，加入腹腔沖洗液中，將陽性組按加入細(xì)胞數(shù)目的不同分為A﹑B﹑C﹑D組，同時(shí)設(shè)立陰性對照組（見表1），每組樣本制備3份。

1.4 卵巢癌裸鼠原位移植模型的復(fù)制

1.4.1 分組 15只7周齡雌性BALB/c裸鼠在無特定病原體環(huán)境下飼養(yǎng)。陽性組和陰性對照組各6只，分別在卵巢注射SKOV3細(xì)胞懸液后4﹑6和8周各處死2只；空白對照組3只，不做處理，分別在4﹑6和8周各處死1只。

1.4.2 卵巢癌裸鼠原位移植模型的復(fù)制 乙醚麻醉裸鼠后，從背部開口，找到左側(cè)卵巢。陽性組用微量注射器向卵巢內(nèi)接種2μl SKOV3細(xì)胞懸液（濃度1×107個(gè)/ml）；陰性對照組注射2μl RPMI 1640培養(yǎng)基，縫合背部傷口，正常飼養(yǎng)。

表1 體外卵巢癌腹水模型

1.4.3 腹水收集 水合氯醛麻醉裸鼠后，打開腹腔，收集腹水；無腹水者收集0.9%生理鹽水的腹腔沖洗液2ml。

1.5 MACS技術(shù)富集腹腔液或腹水的SKOV3細(xì)胞

采用MACS技術(shù)富集腹腔液或腹水的SKOV3細(xì)胞。離心腹腔液或腹水，取細(xì)胞5×107個(gè)，加入100μl FcR封閉液后混勻，加入100μl CD326磁珠，混勻后4℃條件下放置30min，洗滌﹑離心后用500μl緩沖液重懸細(xì)胞。將細(xì)胞懸液加入磁力架的MS分選柱中，待細(xì)胞懸液流凈后用緩沖液洗滌柱子，將MS分選柱從磁力架中取出，放置于收集管中，用適量的緩沖液將柱子上標(biāo)記的CD326細(xì)胞洗滌下來，再次洗滌﹑離心后用50μl緩沖液重懸，涂片。

1.6 ICC-FISH

1.6.1 涂片固定 室溫下丙酮固定細(xì)胞涂片10min，晾干。

1.6.2 ICC 涂片上加藻紅蛋白（Phycoerythrin, PE）標(biāo)記的EBA-1抗體，4℃過夜，4℃條件下磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline, PBS）洗滌3次，0.1%Triton室溫作用5min，PBS室溫洗滌3次，70%﹑85%和100%冰冷酒精梯度脫水，在甲醇﹑冰醋酸（比例3∶1）液中固定10min，蒸餾水沖洗。4℃條件下用1%多聚甲醛（2×SSC緩沖液，pH 7.6）固定10min，蒸餾水沖洗，70%﹑85%和100%冰冷酒精梯度脫水，晾干。

1.6.3 FISH 將橙色熒光標(biāo)記的CEP8 1μl﹑雙蒸水2μl及Buffer 7μl混勻，將10μl探針液加于涂片的待雜交區(qū)，蓋上蓋玻片封片，放于72℃水浴鍋8min，然后置于37℃的濕盒16 h。

1.6.4 洗片 去除蓋玻片，將涂片置于65℃的0.4×SSC緩沖液或0.3%吐溫中洗滌2min，再置于室溫2×SSC緩沖液或0.1%吐溫中洗滌1min，風(fēng)干。

1.6.5 復(fù)染 涂片上滴加10μl 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole, DAPI）于雜交區(qū)，15min后在激光掃描共聚焦顯微下觀察。

2 結(jié)果

2.1 體外卵巢癌腹水模型的檢測結(jié)果

陰性對照組和陽性組可見EBA-1陽性細(xì)胞，D組EBA-1陽性細(xì)胞數(shù)量最多。陰性對照組無Mito-Tracker Green陽性細(xì)胞，陽性組均見Mito-Tracker Green陽性細(xì)胞，隨著各組癌細(xì)胞數(shù)量增多，Mito-Tracker Green陽性細(xì)胞數(shù)量呈增多趨勢，共計(jì)73個(gè)。按公式：回收率=Mito-Tracker Green陽性細(xì)胞數(shù)/SKOV3細(xì)胞數(shù)，計(jì)算各樣本SKOV3細(xì)胞的回收率為20%～50%。以CEP8＞2個(gè)為FISH陽性標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定DAPI+/EBA-1+/Mito-Tracker Green+/CEP8+細(xì)胞為癌細(xì)胞，陰性對照組和1個(gè)A組（5個(gè)癌細(xì)胞）樣本為FISH陰性，其他陽性組均見FISH陽性細(xì)胞，共69個(gè)，比Mito-Tracker Green陽性細(xì)胞少4個(gè)，4個(gè)未檢測到的細(xì)胞中，1個(gè)細(xì)胞見2個(gè)著絲粒，1個(gè)細(xì)胞見1個(gè)著絲粒，2個(gè)細(xì)胞的熒光信號(hào)模糊不清，無法判讀。按公式：檢測率=FISH陽性細(xì)胞/Mito-Tracker Green陽性細(xì)胞，12個(gè)SKOV3細(xì)胞陽性樣本中有9個(gè)樣本的檢測率為100%。見表2。

表2 卵巢癌腹水模型的檢測結(jié)果

以D組為例，在涂片上可見單個(gè)和簇狀排列的細(xì)胞，簇狀細(xì)胞的熒光信號(hào)較弱，而單個(gè)細(xì)胞的熒光信號(hào)較強(qiáng)，Mito-Tracker Green陽性細(xì)胞為單個(gè)排列的細(xì)胞，即SKOV3細(xì)胞，其DAPI和EBA-1-PE染色均為陽性，且多數(shù)細(xì)胞有≥3個(gè)8號(hào)染色體著絲粒信號(hào)。Mito-Tracker green陰性細(xì)胞多數(shù)呈簇狀排列，DAPI和EBA-1-PE染色為陽性，一般可見2個(gè)8號(hào)染色體著絲粒信號(hào)，被判讀為良性上皮細(xì)胞。見圖1。

大多數(shù)Mito-Tracker Green陽性的SKOV3細(xì)胞有≥3個(gè)8號(hào)染色體著絲粒信號(hào)，但有1個(gè)SKOV3細(xì)胞僅見1個(gè)信號(hào)，另1個(gè)細(xì)胞見2個(gè)信號(hào)。見圖2。

2.2 卵巢癌裸鼠原位移植模型的檢測結(jié)果

陽性組裸鼠注射SKOV3細(xì)胞4周后腹部增大，收集到2 ml血性渾濁腹水。隨著飼養(yǎng)時(shí)間延長，陽性組裸鼠腹圍不斷增大，逐漸消瘦，6周收集的腹水量3.5～4.0 ml，8周收集的腹水量約5 ml左右。陰性對照組裸鼠與空白對照組裸鼠一樣，生長良好，無腹水，以2 ml腹腔沖洗液替代腹水。

隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長，陽性組裸鼠腹水中的細(xì)胞總數(shù)不斷增多，分離出的SKOV3細(xì)胞數(shù)量也逐漸增多。在顯微鏡下，4﹑6和8周每個(gè)視野的SKOV3細(xì)胞數(shù)最多分別為3﹑8和15個(gè)。陰性對照組和空白對照組未分選出CD326和EBA-1陽性細(xì)胞。見圖3。

圖1 D組的SKOV3細(xì)胞 （ICC-FISH×100）

圖2 SKOV3細(xì)胞8號(hào)染色體著絲粒信號(hào) （ICC-FISH×400）

圖3 卵巢癌裸鼠原位移植模型腹水中的SKOV3細(xì)胞 （ICC-FISH×200）

3 討論

迄今為止，尚無行之有效方法可降低卵巢癌﹑輸卵管癌﹑腹膜癌的致死率。卵巢癌被發(fā)現(xiàn)時(shí)，往往已形成較大腫塊或處于進(jìn)展期，盆腹腔內(nèi)除肉眼可見的轉(zhuǎn)移灶外，還會(huì)有廣泛的微轉(zhuǎn)移，這些病灶不可能被切除，致使2～3年后疾病復(fù)發(fā)，故需要更詳盡地了解卵巢癌種植轉(zhuǎn)移情況。卵巢癌的發(fā)生﹑發(fā)展具有復(fù)雜的遺傳學(xué)及微環(huán)境因素。卵巢癌起源于輸卵管傘端的脫落上皮細(xì)胞或癌細(xì)胞，與大多數(shù)其他實(shí)體瘤不同，卵巢癌較少血行轉(zhuǎn)移，多數(shù)為腹腔種植轉(zhuǎn)移。其腹腔種植的早期事件是在蛋白酶的介導(dǎo)下，單個(gè)癌細(xì)胞或細(xì)胞球脫離進(jìn)入腹腔，黏附于間皮被覆的腹膜或器官，扎根于間皮下基質(zhì)并形成繼發(fā)性腫瘤。卵巢癌播散性轉(zhuǎn)移與腹水的產(chǎn)生密切相關(guān)，腹水的微環(huán)境有利于單個(gè)或簇狀癌細(xì)胞的種植轉(zhuǎn)移[4]，而種植轉(zhuǎn)移直接影響患者的死亡率。所以，腹腔液是研究卵巢癌及其微環(huán)境的良好取材來源，可以提供癌細(xì)胞及其他細(xì)胞，以了解卵巢癌轉(zhuǎn)移過程中的細(xì)胞分子改變[5]。

液體活檢是一種新型的無創(chuàng)檢測技術(shù)，是通過采集患者的體液對體內(nèi)腫瘤進(jìn)行檢測的方法，在科研和臨床上廣泛用于檢測外周循環(huán)血癌細(xì)胞的數(shù)量及其分子病理特征，其包括分離富集﹑分析檢測2個(gè)步驟。分離富集通?；诎┘?xì)胞的物理性質(zhì)（密度和大小）或免疫學(xué)特征（分子特征），包括梯度離心法﹑過濾法﹑免疫磁性分選法等；分析檢測可分為細(xì)胞計(jì)數(shù)法和核酸檢測法，如免疫細(xì)胞化學(xué)法﹑逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)等[6]。已經(jīng)有一些學(xué)者用免疫磁珠富集胸腹水中的癌細(xì)胞[7-8]。KIMURA等[7]用CD45+免疫磁珠負(fù)分選卵巢癌腹水后，用FACS鑒定分選后的癌細(xì)胞純度，然后用純化的癌細(xì)胞提取癌細(xì)胞溶解產(chǎn)物，以制備腫瘤特異性疫苗。HUANG等[8]用Immunomagnetic Flow系統(tǒng)檢測外周血中游離葉酸受體和葉酸受體陽性的癌細(xì)胞，證明該系統(tǒng)可以用于檢測卵巢癌腹水中的葉酸受體陽性細(xì)胞。伴隨著組織學(xué)分析﹑重要生物學(xué)檢測等發(fā)展，從體液中分選細(xì)胞的關(guān)鍵挑戰(zhàn)不再是分選效率，而是目的細(xì)胞的高純度[9]。純度好的癌細(xì)胞被分離后，可精確了解癌細(xì)胞的生物學(xué)特性及治療變化等。AHMED等[10]分離了未化療卵巢癌和復(fù)發(fā)后化療耐藥患者的腹水癌細(xì)胞，用蛋白組學(xué)技術(shù)識(shí)別到癌細(xì)胞上的353種蛋白，發(fā)現(xiàn)這兩組細(xì)胞在免疫監(jiān)視﹑DNA修復(fù)機(jī)制﹑細(xì)胞骨架重排﹑細(xì)胞間黏附﹑細(xì)胞周期﹑細(xì)胞運(yùn)輸?shù)鹊牡鞍拙幋a上有很大的不同；其路徑分析顯示，耐藥癌細(xì)胞具有豐富的新陳代謝途徑﹑DNA修復(fù)機(jī)制及能量代謝途徑。

文獻(xiàn)報(bào)道EpCAM在87%～100%的癌性腹水中表達(dá)，高表達(dá)EpCAM的癌細(xì)胞是化療耐藥細(xì)胞，這些細(xì)胞是化療后復(fù)發(fā)的根源，與患者預(yù)后差相關(guān)[11]。CD326和EBA-1都是EpCAM的單克隆抗體。根據(jù)癌性腹水或腹腔沖洗液量多的特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)采用MACS技術(shù)，用CD326免疫磁珠進(jìn)行正分選，除去腹水中的炎癥細(xì)胞﹑間皮細(xì)胞及纖維細(xì)胞等，使CD326陽性細(xì)胞富集，以適用于后繼的純化或鑒定過程。既往實(shí)驗(yàn)顯示，惡性腹腔液正分選后的液體中既有良性的上皮細(xì)胞又有癌細(xì)胞[3]。因此識(shí)別腫瘤相關(guān)上皮性抗原的技術(shù)不能精確地鑒定分離腹腔液中的癌細(xì)胞，而文獻(xiàn)報(bào)道卵巢癌頻繁出現(xiàn)8號(hào)染色體多倍體[12]，針對以上特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)選擇ICC-FISH來區(qū)分癌細(xì)胞與良性上皮細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，陰性組和陽性組均有EBA-1陽性而Mito-Tracker Green無著色的細(xì)胞，再次驗(yàn)證腹水中存在較多的良性上皮細(xì)胞，這些上皮細(xì)胞黏附性好，在涂片上主要呈簇狀排列，Mito-Tracker Green著色的SKOV3細(xì)胞主要呈分散單個(gè)排列。以觀察到的Mito-Tracker Green標(biāo)記細(xì)胞為準(zhǔn)，SKOV3細(xì)胞的回收率為20%～50%，為提高癌細(xì)胞的回收率，實(shí)驗(yàn)使SKOV3細(xì)胞與CD326免疫磁珠充分混勻孵育，并控制進(jìn)入MS柱子的細(xì)胞的濃度，務(wù)必使連接了癌細(xì)胞的免疫磁珠與柱子充分結(jié)合，以提高正分選的效率?？赡茉诖胖楦患秃罄m(xù)鑒定操作過程中的細(xì)胞損失太多，也可能是正常上皮細(xì)胞對少量癌細(xì)胞的干擾太大，所以本實(shí)驗(yàn)難以像分選外周血循環(huán)細(xì)胞一樣回收到僅1個(gè)癌細(xì)胞[12-14]。FISH檢測結(jié)果顯示，大多數(shù)SKOV3細(xì)胞有3個(gè)CEP8信號(hào)，僅少數(shù)細(xì)胞可見1或2個(gè)CEP8信號(hào)，9/12個(gè)SKOV3細(xì)胞陽性樣本的檢測率為100%，說明用FISH檢測多倍體細(xì)胞來識(shí)別卵巢癌細(xì)胞是可行的。但是，如果用既表達(dá)EpCAM抗原，且CEP8＞2的標(biāo)準(zhǔn)來鑒定癌性腹水富集液，可能會(huì)導(dǎo)致癌細(xì)胞的遺漏。另外，EpCAM抗體不能捕獲或檢測到發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的癌細(xì)胞，這種癌細(xì)胞最易從癌灶脫落進(jìn)入腹腔或脈管，所以應(yīng)設(shè)計(jì)對卵巢癌腹水更特異的免疫磁珠或熒光抗體，如選用CD45+免疫磁珠進(jìn)行負(fù)分選，根據(jù)不同卵巢癌的特征搭配葉酸受體﹑P53﹑Pax8等抗體進(jìn)行特異的癌細(xì)胞分選。

卵巢癌裸鼠原位模型復(fù)制了卵巢癌的發(fā)生﹑發(fā)展過程，其惡性腹水的產(chǎn)生也經(jīng)歷了從無到有，到量多的過程。由于卵巢癌患者早期無明顯癥狀，本實(shí)驗(yàn)選擇裸鼠腹圍出現(xiàn)肉眼可見的增大時(shí)開始收集腹水。實(shí)驗(yàn)證明，ICC-FISH在腹水中癌細(xì)胞量少或量多時(shí)都能可靠地分離出癌細(xì)胞，與分離循環(huán)血癌細(xì)胞相似[12]。

與腹腔鏡下活檢相比，從腹水或腹腔沖洗液中分離并檢測癌細(xì)胞，損傷小﹑可重復(fù)，腹水中的癌細(xì)胞有上皮樣表型，也有發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的表型，這些細(xì)胞高表達(dá)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，具有強(qiáng)大的自我更新﹑轉(zhuǎn)移和腫瘤形成能力[15]，分離腹水中的癌細(xì)胞可以實(shí)時(shí)了解腫瘤的生物學(xué)特性，從而更有機(jī)會(huì)辨識(shí)和確定藥物治療靶點(diǎn)及預(yù)后標(biāo)志物[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，將惡性腹水磁富集后，ICC-FISH可以穩(wěn)定﹑敏感地分離其中的少量癌細(xì)胞，該方法為卵巢癌的早期發(fā)現(xiàn)﹑監(jiān)測復(fù)發(fā)及指導(dǎo)治療提供新思路。

參 考 文 獻(xiàn)：

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