耿同會(huì)，徐金升，韓迎迎，白亞玲，張俊霞，崔立文，張勝雷

（河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院 腎內(nèi)科，河北 石家莊 050011）

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease, CKD）患者心血管疾病發(fā)病率是普通人群的10～30倍[1]，血管鈣化為主要危險(xiǎn)因素[2]。血管鈣化是細(xì)胞介導(dǎo)的生物礦化過程[3]，血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）表型轉(zhuǎn)化是其重要機(jī)制[4]。代謝性酸中毒是CKD患者常見的并發(fā)癥。研究發(fā)現(xiàn)，酸性環(huán)境可抑制大鼠血管鈣化，但具體機(jī)制尚不明確[5]。活化T細(xì)胞核因子（nuclear factor of activated T cells, NFAT）是一種有多種調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子，GOETTSCH等[6]發(fā)現(xiàn)，NFATc1對(duì)血管鈣化有促進(jìn)作用。因此筆者推測(cè)，酸性環(huán)境可能通過下調(diào)NFATc1表達(dá)，抑制血管鈣化。本實(shí)驗(yàn)以大鼠VSMCs為研究對(duì)象，旨在探討酸性環(huán)境對(duì)高磷誘導(dǎo)大鼠VSMCs鈣化的影響及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6只4周齡健康雄性SD大鼠，原代培養(yǎng)大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，大鼠購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證標(biāo)號(hào)：1305090。

1.1.2 主要儀器和試劑 倒置相差顯微鏡（LH50A型）（日本Olympus公司），CYTATION3型酶標(biāo)儀（美國(guó)Biotek公司），胎牛血清﹑細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，β－甘油磷酸（美國(guó)Sigma公司），酸度計(jì)（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），堿性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）活性試劑盒（南京建成生物工程研究所），鈣含量測(cè)定試劑盒（北京中生北控生物科技股份有限公司），RNA提取試劑盒﹑RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Thermo公司），PCR引物（上海英濰捷基公司），NFATc1﹑Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（runt related transcription factor 2, Runx2）抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，GAPDH抗體（美國(guó)Bioworld公司）。

1.2 方法

1.2.1 鈣化VSMCs的制備及分組 取4周齡健康雄性SD大鼠的胸主動(dòng)脈，采用組織塊貼壁法培養(yǎng)原代VSMCs，實(shí)驗(yàn)取3～5代細(xì)胞。采用隨機(jī)數(shù)字表法，將VSMCs隨機(jī)分為正常對(duì)照組﹑高磷＋pH 7.4組﹑高磷＋pH 7.1組。正常對(duì)照組用含10%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，調(diào)整pH值至7.4；高磷＋pH 7.4組在10%胎牛血清培養(yǎng)基中加入10 mmol/L β-甘油磷酸，調(diào)整pH值至7.4；高磷＋pH 7.1組用高磷培養(yǎng)基，調(diào)整pH值至7.1。使用1 mol/L鹽酸HCl和7.4%碳酸氫鈉調(diào)整培養(yǎng)基pH值，換液1次/24 h。

1.2.2 細(xì)胞鈣含量測(cè)定 將24孔板內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞干預(yù)14 d后，棄上清液，用1 mmol/L HCl消化過夜，取上清，使用鄰甲酚酞絡(luò)合酮比色法測(cè)定鈣含量；細(xì)胞用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液和0.1%十二烷基硫酸鈉溶解30min，根據(jù)吸光度值計(jì)算細(xì)胞蛋白含量。VSMCs的鈣含量結(jié)果用細(xì)胞鈣含量與蛋白含量的比值表示（mg/g）。

1.2.3 茜素紅染色 取4～5代細(xì)胞以5×104個(gè)/孔密度接種于24孔板內(nèi)，干預(yù)14 d。用pH 8.4濃度為0.1%的茜素紅染液進(jìn)行鈣化染色，倒置顯微鏡下觀察照相。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：鈣鹽沉積為橘紅色。

1.2.4 ALP活性測(cè)定 將細(xì)胞培養(yǎng)14 d后棄上清，磷酸鹽緩沖溶液沖洗2次，加入1%聚乙二醇辛基苯基醚生理鹽水，置于4℃冷藏24 h后離心，取上清液，按ALP活性試劑盒說明書操作，測(cè)定其活性，結(jié)果用蛋白質(zhì)校準(zhǔn)。

1.2.5 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptionpolymerase chain reaction, RT-PCR） RT-PCR檢測(cè)VSMCs目的基因的表達(dá)。干預(yù)4 d后提取各組細(xì)胞mRNA，測(cè)定NFATc1和Runx2基因的表達(dá)。PCR引物由Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系為20μl，NFATc1反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，共32個(gè)循環(huán)；GAPDH反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，共32個(gè)循環(huán)；Runx2反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，共28個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸10min。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 Western blot檢測(cè) Western blot檢測(cè)VSMCs目的蛋白的表達(dá)。干預(yù)4 d后提取各組細(xì)胞蛋白，測(cè)定NFATc1和Runx2蛋白的表達(dá)。細(xì)胞蛋白質(zhì)用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜﹑封閉，加入一抗稀釋液（NFATc1 1∶1 000，Runx2 1∶500，GAPDH 1∶5 000），4℃孵育過夜。洗膜，放入二抗稀釋液（1∶5 000），室溫下孵育1 h，定影顯色，分析條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)；相關(guān)性分析用Pearson法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 酸性環(huán)境對(duì)高磷誘導(dǎo)VSMCs鈣化的影響

干預(yù)14 d后，正常對(duì)照組﹑高磷＋pH 7.4組﹑高磷＋pH 7.1組VSMCs的鈣含量分別為（47.423±10.515）﹑（119.306±13.443） 和（89.738±12.542）mg/g，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=22.138，P=0.0017）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)SNK-q檢驗(yàn)，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。高磷環(huán)境下大鼠VSMCs鈣含量水平升高；pH值降低時(shí)VSMCs鈣含量減少。

與鈣含量結(jié)果類似，茜素紅染色可見正常對(duì)照組VSMCs無橘紅色鈣鹽結(jié)節(jié)出現(xiàn)，高磷組有大量橘紅色鈣鹽沉積，而酸干預(yù)可使鈣鹽沉積減少。見圖1。

2.2 酸性環(huán)境對(duì)高磷誘導(dǎo)VSMCs表型轉(zhuǎn)化的影響

正常對(duì)照組﹑高磷＋pH 7.4組﹑高磷＋pH 7.1組VSMCs的ALP活性分別為（32.510±2.393）﹑（106.206±4.294）和（85.715±6.227）u/g，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=40.909，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)SNK-q檢驗(yàn)，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。高磷＋pH 7.4組ALP活性高于正常對(duì)照組；酸干預(yù)后ALP活性降低。

正常對(duì)照組﹑高磷+pH 7.1組﹑高磷+pH 7.4組VSMCs的Runx2 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為（0.213±0.008）﹑（0.317±0.054）和（0.562±0.070），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=36.924，P=0.000）。正常對(duì)照組﹑高磷+pH 7.1組﹑高磷+pH 7.4組VSMCs的Runx2 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（0.390±0.108）﹑（0.785±0.069）和（1.095±0.121），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=36.408，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)SNK-q檢驗(yàn)，正常對(duì)照組﹑高磷＋pH 7.1組Runx2 mRNA和蛋白表達(dá)水平較高磷＋pH 7.4組低（P＜0.05），表明酸性環(huán)境可下調(diào)Runx2表達(dá)。見圖2。

2.3 酸性環(huán)境對(duì)高磷誘導(dǎo)的VSMCs中NFATc1表達(dá)的影響

正常對(duì)照組﹑高磷+pH 7.1組﹑高磷+pH 7.4組VSMCs的NFATc1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為（0.264±0.043）﹑（0.419±0.073 ）和（0.668±0.097），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=22.512，P=0.002）。正常對(duì)照組﹑高磷+pH 7.1組﹑高磷+pH 7.4組VSMCs的NFATc1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（0.155±0.066）﹑（0.362±0.031）和（0.661±0.096），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=36.408，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)SNK-q檢驗(yàn)，正常對(duì)照組﹑高磷＋pH 7.1組NFATc1 mRNA和蛋白表達(dá)水平較高磷＋pH 7.4組低（P＜0.05），高磷環(huán)境NFATc1表達(dá)升高。見圖3。

2.4 NFATc1與Runx2、ALP的相關(guān)性

VSMCs中NFATc1與Runx2表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.801，P=0.003），NFATc1與ALP活性呈正相關(guān)（r=0.698，P=0.002）。

圖1 各組大鼠VSMCs鈣鹽沉積 （茜素紅染色）

圖2 各組大鼠VSMCs的Runx2 mRNA和蛋白的表達(dá)

圖3 各組大鼠VSMCs的NFATc1 mRNA和蛋白的表達(dá)

3 討論

代謝性酸中毒是CKD患者的常見并發(fā)癥。近期研究發(fā)現(xiàn)，代謝性酸中毒可以抑制VSMCs表型轉(zhuǎn)化[4]。近年來就酸性環(huán)境對(duì)骨形成的作用研究較為深入，然而其對(duì)血管鈣化的作用研究甚少，僅證實(shí)VSMCs成骨/成軟骨表型轉(zhuǎn)化是其重要機(jī)制之一[7]，因此，可將酸性環(huán)境對(duì)成骨作用的影響推演到血管鈣化上。血管鈣化是CKD患者發(fā)生心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素，不同于普通人群發(fā)生的動(dòng)脈粥樣硬化，CKD患者以血管中膜鈣化為突出表現(xiàn)[8]。VSMCs作為血管中膜的重要成分，在血管鈣化發(fā)生過程中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)VSMCs，深入探討酸性環(huán)境對(duì)VSMCs鈣化的影響，發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比，高磷刺激加重VSMCs鈣化，酸刺激可抑制高磷誘導(dǎo)的VSMCs鈣化。

血管鈣化是多因素共同參與的復(fù)雜病理過程，其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。血管鈣化常常伴隨Runx2和ALP等成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)[7]。Runx2是Runt結(jié)構(gòu)域基因家族一員，可結(jié)合成骨細(xì)胞特異性順式作用元件，調(diào)控下游骨基質(zhì)和骨膠原的產(chǎn)生，參與成骨細(xì)胞分化[7]。ALP亦是成骨細(xì)胞形成的早期標(biāo)志物。兩者在正常VSMCs中表達(dá)較低，在鈣化的血管和心臟瓣膜組織中表達(dá)升高[9]。因此，可以憑借VSMCs中Runx2的表達(dá)量和ALP活性推測(cè)其是否發(fā)生成骨樣表型轉(zhuǎn)化。本研究結(jié)果顯示，與高磷＋pH 7.4組相比，高磷+pH 7.1組VSMCs的Runx2表達(dá)和ALP活性降低，提示高酸性環(huán)境抑制VSMCs鈣化的機(jī)制可能是抑制VSMCs發(fā)生成骨樣表型轉(zhuǎn)化。

NFAT最初在T細(xì)胞中因其免疫調(diào)控作用被發(fā)現(xiàn)，之后發(fā)現(xiàn)除免疫系統(tǒng)外，NFAT轉(zhuǎn)錄因子在其他組織也有廣泛分布，如心肌﹑骨骼肌﹑卵巢等組織，具有多種生理功能，如參與刺激T細(xì)胞活化﹑成骨細(xì)胞分化和成骨作用﹑破骨細(xì)胞分化，調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞及VSMCs增殖[10]。NFAT家族蛋白活性主要由Ca2+/鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（Calcineurin, CaN）調(diào)節(jié)。當(dāng)Ca2+﹑鈣調(diào)節(jié)蛋白與CaN結(jié)合后誘發(fā)CaN構(gòu)象改變，使自身抑制域移位，暴露出活性位點(diǎn)，導(dǎo)致CaN活化，繼而使細(xì)胞漿中NFAT脫磷酸化，暴露其核定位信號(hào)，NFAT得以轉(zhuǎn)位入核，與核內(nèi)其他轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同調(diào)節(jié)多種基因的活化[11]。研究表明，在VSMCs中，NFATcl高表達(dá)，NFATc3少量表達(dá)，而NFATc2和NFATc4幾乎不表達(dá)[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，在氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)VSMC鈣化過程中，NFAT發(fā)揮重要作用，敲除NFAT基因能抑制Runx2表達(dá)和基質(zhì)礦化[6]。以上研究表明，NFATc1在血管鈣化中發(fā)揮重要作用，因此筆者推測(cè)NFATc1可能參與酸抑制VSMCs鈣化的過程。本研究從體外實(shí)驗(yàn)觀察VSMCs中NFATc1的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高磷＋pH 7.4組VSMCs中NFATc1表達(dá)高于正常對(duì)照組，提示NFATc1參與慢性腎衰竭大鼠血管鈣化的發(fā)生，可能對(duì)其有促進(jìn)作用；進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，酸性環(huán)境能夠抑制VSMCs中NFATc1 mRNA和蛋白的表達(dá)，由此推測(cè)NFATc1可能是酸抑制VSMCs鈣化發(fā)生的因素之一。

NFATc1在酸抑制高磷誘導(dǎo)的VSMCs鈣化中如何發(fā)揮作用？本研究就VSMCs中NFATc1蛋白表達(dá)水平與表型轉(zhuǎn)化指標(biāo)（ALP活性和Runx2蛋白表達(dá)水平）做相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NFATc1與Runx2蛋白表達(dá)﹑ALP活性呈正相關(guān)。因此，筆者推測(cè)酸抑制VSMCs發(fā)生鈣化的可能機(jī)制是通過降低NFATc1表達(dá)，抑制VSMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化來實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本研究通過體外研究發(fā)現(xiàn)，酸性環(huán)境可以抑制高磷誘導(dǎo)的大鼠VSMCs鈣化，其可能機(jī)制是通過降低NFATc1表達(dá)，抑制VSMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化來實(shí)現(xiàn)的。但本研究?jī)H從實(shí)驗(yàn)室內(nèi)觀察到NFATc1在酸抑制血管鈣化中的作用，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究，以期為臨床預(yù)防和治療CKD患者的血管鈣化提供新靶點(diǎn)。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1]JHA V, GARCIA-GARCIA G, ISEKI K, et al. Chronic kidney disease: global dimension and perspectives[J]. Lancet, 2013,382(9888): 260-272.

[2]白亞玲, 徐金升, 武嬌, 等. 慢性腎臟病大鼠血管收縮張力與血管鈣化的關(guān)系[J]. 中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志, 2014, 24(11): 19-23.

[3]LIU Y, LIN F, FU Y, et al. Cortistatin inhibits calcification of vascular smooth muscle cells by depressing osteoblastic differentiation and endoplasmic reticulum stress[J]. Amino Acids,2016, 48(11): 2671-2681.

[4]管思明, 辛華平, 方欣, 等. 血管中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在不同鈣化環(huán)境中的分化研究[J]. 中華老年醫(yī)學(xué)雜志, 2014, 33: 916-919.

[5]MENDOZA F J, LOPEZ I, MONTES de OCA A, et al. Metabolic acidosis inhibits soft tissue calcification in uremic rats[J]. Kidney Int, 2008, 73(4): 407-414.

[6]GOETTSCH C, RAUNER M, HAMANN C, et al. Nuclear factor of activated T cells mediates oxidised LDL-induced calcification of vascular smooth muscle cells[J]. Diabetologia, 2011, 54: 2690-2701.

[7]DEMER L L, TINTUT Y. Inflammatory, metabolic, and genetic mechanisms of vascular calcification[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2014, 34: 715-723.

[8]LANZER P, BOEHM M, SORRIBAS V, et al. Medial vascular calcification revisited: review and perspectives[J]. Eur Heart J,2014, 35: 1515-1525.

[9]ZHOU S, FANG X, XIN H, et al. Osteoprotegerin inhibits calcification of vascular smooth muscle cell via down regulation of the Notch1-RBP-Jkappa/Msx2 signaling pathway[J]. PLoS One,2013, 8(7): DOI: 10.1371/journal.pone.68987.

[10]QIN J J, NAG S, WANG W, et al. NFAT as cancer target: mission possible[J]. Biochim Biophys Acta, 2014, 1846: 297-311.

[11]CHOO M K, YEO H, ZAYZAFOON M. NFATc1 mediates HDAC-dependent transcriptional repression of osteocalcin expression during osteoblast differentiation[J]. Bone, 2009, 45:579-589.

[12]WADA H, HASEGAWA K, MORIMOTO T, et al. Calcineurin-GATA-6 pathway is involved in smooth muscle-specific transcription[J]. J Cell Biol, 2002, 156: 983-991.