魯明霞 王紅崗 胡仁標

1 浙江省金華市人民醫(yī)院 浙江 金華 321000 2 福建省寧德市人民醫(yī)院 福建 寧德 352000

支氣管哮喘是一種反復發(fā)作氣道變應性炎癥所導致的以氣道反應性增高、氣道阻塞為特點的臨床多發(fā)病。氣道重構的形成是支氣管哮喘治療的難點。近年來，有關細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）通道在哮喘發(fā)病機制中作用的研究逐漸成為國內(nèi)外的研究熱點之一，它涉及哮喘氣道慢性炎癥、氣道高反應性以及氣道重建等多個方面。很多研究結果表明：ERK可能參與了氣道重構中平滑肌的增殖過程[1]；ERK通路是多數(shù)生長因子和炎癥介質調(diào)控氣道平滑肌細胞(ASMC)增殖的關鍵性途徑。筆者在臨床工作中，采用中藥驗方加減紫草辨證治療支氣管哮喘，取得了較好的療效。紫草素為紫草的主要成分，因此，研究者采用“卵蛋白（OVA）注射并霧化吸入”的方法，制作藥物性支氣管哮喘大鼠模型，并給予紫草素進行干預，研究其對支氣管哮喘大鼠模型的影響，從而揭示紫草素在干預支氣管哮喘氣道重構方面的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：健康雄性SD大鼠40只，SPF級別，體重200±20g，購自浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心。

1.2 藥品與試劑：紫草素（規(guī)格5mg/支，批號：160702），購自南京康滿林化工實業(yè)有限公司，強的松片(規(guī)格5mg/片，批號1101609)購自阿特維斯制藥有限公司。1.3 方法：分述如下。

1.3.1 動物模型建立與分組：40只SD大鼠隨機抽取(采用隨機數(shù)字表法）30只進行模型建立，采用卵蛋白（OVA）皮下注射并霧化吸入復制大鼠慢性哮喘模型，分致敏和激發(fā)兩步。具體方法如下：大鼠在第1、第8天，后腿皮下注射含OVA(10mg)加氫氧化鋁(200mg)生理鹽水1mL致敏；將大鼠置于一半密閉容器中，于第15天開始用超聲霧化器以2%OVA生理鹽水50mL霧化激發(fā)，每次30min，每周3次，連續(xù)6周。以大鼠出現(xiàn)煩躁、嗆咳、氣促、呼吸深快及活動量下降等哮喘典型的發(fā)作癥狀，代表激發(fā)成功。造模后隨機分為3組：模型組、強的松組和紫草素組。剩余10只未造模的大鼠設為空白組，各組大鼠分別稱重。

1.3.2 給藥：各組大鼠從第1次哮喘激發(fā)之日起開始給藥，每次激發(fā)前30min給予藥物灌胃干預（不激發(fā)之日給藥時間固定在同一時間點），各組大鼠用藥量按人與動物的體表而積換算，空白給予灌胃生理鹽水2ml/100g，每日1次，連續(xù)6周；模型組給予灌胃生理鹽水2ml/100g，每日1次，連續(xù)6周；強的松組給予灌胃胃強的松片溶液0.4mg/100g；紫草素組給予灌胃紫草素溶液2.5mg/kg,每日1次，連續(xù)6周。

1.3.3 標本采?。阂陨?組均在實驗的第42天采用頸靜脈取血后行頸動脈放血處死，采集血清用于檢測血清LN、PCⅢ含量，分離出氣管和肺，取左肺行支氣管肺泡灌洗。取右肺拍照后至于10%中性福爾馬林溶液中浸泡固定。

1.3.4 肺組織病理切片制作：將固定24h的肺組織，按病理切片制作方法，常規(guī)取材脫水、石蠟包埋、切片，行DAB染色，中性樹膠封片，并在顯微鏡100倍視野下觀察肺組織結構變化、管壁纖維增生程度及管腔變形狹窄等方面選，取典型視野并拍照。然后再使用Image-Pro-Plus 5.0圖像分析軟件對各細支氣管管壁厚度、面積、周長進行測量。

1.3.5 肺組織ERK1含量測定：左下肺組織勻漿進，采用免疫組織法檢測ERK1表達。

2 結果

2.1 肺組織病理結果：光學顯微鏡觀察結果顯示，正常對照組肺組織正常，無炎性細胞，無間質纖維組織增生。模型組大鼠的肺泡炎比較明顯，肺泡間隔增寬，肺泡壁破壞，部分肺泡實變，可見大量嗜酸性細胞，細支氣管壁厚度、面積明顯增大，細胞及漿細胞，氣道重塑明顯。紫草素組和強的松組大鼠，肺泡間隔輕度增寬，肺泡炎癥不明顯。

2.2 氣道重構病理結果：除空白組外各組大鼠氣道均出現(xiàn)不同程度的炎癥細胞浸潤和氣道重塑。各組大鼠細支氣管管壁厚度、管壁面積、管壁面積/腔周長比較結果。見表1。

表1 各組大鼠細支氣管管壁厚度、管壁面積、管壁面積/腔周長統(tǒng)計結果（±s）

表1 各組大鼠細支氣管管壁厚度、管壁面積、管壁面積/腔周長統(tǒng)計結果（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

空白組模型組強的松組紫草素組4.09±0.81 4.73±0.26*4.53±0.12*#4.31±0.06*#10 10 10 10 3.03±1.12 5.01±1.46*4.19±0.25*#4.08±1.24*#10.67±0.35 13.04±0.71*11.70±1.42*#11.53±0.15*#

2.3 各組大鼠白細胞和嗜酸性粒細胞計數(shù)結果：見表2。

表2 各組大鼠白細胞計數(shù)和嗜酸性粒細胞計數(shù)（×104/ml）

2.4 紫草素對哮喘大鼠血清LN、PCⅢ水平的影響：見表3。2.5 ERK1表達測定結果：ERK1在模型組較為廣泛表達，主要表達在氣道平滑肌細胞、肺泡和或間質內(nèi)的組織細胞(吞噬細胞)、纖維細胞和炎癥細胞及血管內(nèi)皮細胞上，在空白組主要表達在肺泡或間質內(nèi)的組織細胞(吞噬細胞)，且表達較弱。在強的松組和紫草素組主要表達在氣道平滑肌細胞，部分不表達,以強的松組較明顯。見表4。

表3 各組大鼠LN、PCⅢ檢測結果（±s）

表3 各組大鼠LN、PCⅢ檢測結果（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

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表4 各組ERK1表達測定結果

3 討論

支氣管哮喘屬于中醫(yī)學“哮證”“喘證”范疇。中醫(yī)學認為，支氣管哮喘多因宿痰內(nèi)伏于肺，每因外感、飲食、情志、勞倦等誘因而引觸，以致痰阻氣道，肺失肅降，氣道攣急。中藥治療支氣管哮喘具有獨特優(yōu)勢，因此單味中藥及其提取物成為尋找治療支氣管哮喘新藥研究方向，有研究顯示，杏仁、地龍可能通過影響血清細胞白介素4（IL-4）、白細胞介素5（IL-5）、免疫球蛋白E（IgE）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細胞因子來起到治療支氣管哮喘的作用[2]。紫草是一種傳統(tǒng)的中草藥，具有抗炎活性，能夠清熱解毒。紫草素的水提取物及醇提取液均有一定的抗炎、解痙、鎮(zhèn)痛作用。紫草素作為一種提取物具有抗病毒、抗菌、抗腫瘤作用。有研究顯示紫草素具有抗菌、抗炎等多種功效，并能調(diào)節(jié)免疫功能及細胞因子的分泌[3]，但目前有關紫草素干預氣道重構方面的研究較少。本實驗結果顯示：哮喘模型組大鼠白細胞計數(shù)及嗜酸性粒細胞計數(shù)均明顯增多,模型組大鼠較空白組支氣管管壁厚度、面積、面積與周長的比值均增大,而平滑肌明顯增厚,血清LN及PCⅢ含量均增高，提示哮喘大鼠有氣道結構的變化。實驗還發(fā)現(xiàn)：與模型組相比，紫草素組及強的松組大鼠白細胞計數(shù)及嗜酸性粒細胞計數(shù)量均明顯減少，且支氣管管壁厚度、面積、面積與周長的比值均減小，血清LN及PCⅢ含量均降低，同時實驗還顯示：強的松組與紫草素組中ERK1表達減弱，與模型組比較均有顯著差異。由此可見紫草素可通過調(diào)節(jié)LN及PCⅢ的含量，減少ERK1在氣道平滑肌細胞中的表達，起到抑制哮喘氣道重構的作用。但是，哮喘氣道重構是一個復雜的病理生理過程，紫草提取物紫草素抑制支氣管哮喘氣道重構其他作用機制仍需進一步深入研究。

4 參考文獻

[1]范曉燕，張煥萍.p-ERK1P2及ERK2mRNA在哮喘大鼠氣道中的表達變化[J].中國比較醫(yī)學雜志，2008,18(3)：14-19.

[2]盧雯雯,吳國琳,余國友.中藥治療支氣管哮喘作用機制初探[J].浙江中醫(yī)雜志，2017,52(4)：299．

[3]詹志來，胡峻，劉談，等.紫草化學成分與藥理活性研究進展[J].中國中藥雜志，2015，40(21)：4127-4135．