張壤心 梁英輝 逯昕明 宋瑞清

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040) (佳木斯大學(xué)) (東北林業(yè)大學(xué))

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，由于化學(xué)農(nóng)藥具有高毒、高殘留的特點(diǎn)，對(duì)空氣、水體、土壤環(huán)境和人類造成的不可預(yù)知危害，因此化學(xué)藥劑的使用正在逐步受到約束。但無害、無殘留的農(nóng)藥一直是專家們研究的方向，所以生物農(nóng)藥成為了當(dāng)下的研究熱點(diǎn)。淡紫擬青霉(Paecilomyceslilacinus)作為植物線蟲重要的生防菌，半個(gè)多世紀(jì)以來都是國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重要研究對(duì)象，并取得了一系列顯著成果。國(guó)際馬鈴薯中心Jatala首先發(fā)現(xiàn)淡紫擬青霉菌對(duì)南方根結(jié)線蟲(Meloidogyneincognita)的卵寄生率高達(dá)60%～70%[1]，另外淡紫擬青霉對(duì)孢囊線蟲(Heteroderasp.)、白色球孢囊線蟲(Globoderpallida)、穿刺線蟲(Tylenchulussp.)、馬鈴薯金線蟲(Globoderarostochiensis)、異皮線蟲(Heteroderidaeschmidtsp.)和珍珠線蟲(Nacobbussp.)等也有很強(qiáng)的寄生能力[2]。目前淡紫擬青霉生物菌劑已廣泛投入生產(chǎn)生活中，用于防治根結(jié)線蟲和胞囊線蟲等有害植物寄生線蟲。

目前，首要解決的問題是實(shí)現(xiàn)淡紫擬青霉的低成本、高效益規(guī)模化生產(chǎn)。許多學(xué)者應(yīng)用廉價(jià)的材料對(duì)淡紫擬青霉的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以降低其生產(chǎn)成本。如Brand et al.利用當(dāng)?shù)刎S富的咖啡豆殼、木薯根渣、脫脂豆、甘蔗渣作為載體來生產(chǎn)淡紫擬青霉[3]；潘滄桑等利用啤酒廠的廢渣、廢液培養(yǎng)淡紫擬青霉，并將其制成菌劑，測(cè)定發(fā)現(xiàn)含孢量為3.4×106個(gè)·g-1[4]；黃永兵等采用玉米秸稈、米糠和玉米粉作為底物固體發(fā)酵淡紫擬青霉[5]。但由于培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)、生產(chǎn)成本過高等問題，以上方法無法滿足淡紫擬青霉孢子的工業(yè)化生產(chǎn)。從工業(yè)生產(chǎn)上考慮，大量生產(chǎn)孢子及菌絲的最適方法是液體發(fā)酵培養(yǎng)。本研究利用搖瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)，以低成本的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基為碳源，探討培養(yǎng)溫度、初始pH值、供氧量和接菌量對(duì)淡紫擬青霉PT1菌株產(chǎn)生孢子和菌絲的影響，以期為該菌今后的大批量工業(yè)化培養(yǎng)提供技術(shù)支撐及理論數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

淡紫擬青霉菌株P(guān)T1來源于中國(guó)林業(yè)科學(xué)院微生物菌株平臺(tái)，保存于東北林業(yè)大學(xué)森林微生物實(shí)驗(yàn)室。

培養(yǎng)基：改良PDA(去皮馬鈴薯200.0 g煮汁，葡萄糖20.0 g，瓊脂粉20.0 g，MgSO41.5 g,KH2PO43.0 g，加水定容至1 000 mL)；改良PD(去皮馬鈴薯200.0 g煮汁，葡萄糖20.0 g，MgSO41.5 g,KH2PO43.0 g，加水定容至1 000 mL)[6]。

1.2 孢子的收集

將保存菌株P(guān)T1接種到PDA平板中心，在25 ℃下培養(yǎng)7 d，待產(chǎn)孢后用15 mL無菌水洗下孢子，調(diào)制成1×107個(gè)·mL-1的孢子懸浮液，4 ℃保存?zhèn)溆肹6]。

1.3 PT1菌株液態(tài)發(fā)酵條件的篩選

溫度對(duì)發(fā)酵液生物量的影響：將200 mL PD培養(yǎng)液加入到500 mL三角瓶中，每瓶中接種孢子懸浮液1 mL，分別在20、23、26、28、30 ℃條件下于160 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 d，并分別在3、5、7 d通過顯微鏡檢查孢子產(chǎn)量，并稱量菌絲的干質(zhì)量。

初始pH值對(duì)發(fā)酵液生物量的影響：在500 mL的三角瓶中分別加入200 mL PD培養(yǎng)液，用1 mol·L-1HCl和NaOH溶液調(diào)配PD培養(yǎng)液的初始pH值分別為3、5、7、9、11、13、15，每瓶中接種孢子懸浮液1 mL，在25 ℃和30 ℃條件下160 r·min-1振蕩培養(yǎng)，7 d后鏡檢并稱量菌絲干質(zhì)量。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。

供氧條件對(duì)發(fā)酵液生物量的影響：分別將50、100、150、200、250 mL的PD培養(yǎng)液加入500 mL三角瓶中，每瓶中接種孢子懸浮液1 mL，在25 ℃和30 ℃條件下160 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 d，分別于3、5、7 d后鏡檢，并稱量菌絲干質(zhì)量。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。

初始接菌量對(duì)發(fā)酵液生物量的影響：將200 mL的PD培養(yǎng)液加入到500 mL三角瓶中，將0.5、1.0、1.5、2.0 mL的孢子懸浮液分別接入瓶中，在25 ℃和30 ℃條件下160 r·min-1振蕩培養(yǎng)，分別于3、5、7 d后鏡檢并稱量菌絲干質(zhì)量。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適溫度的篩選

在不同溫度條件下，菌株P(guān)T1孢子的產(chǎn)量和菌絲生物量見表1。由表1可知，菌株P(guān)T1孢子的產(chǎn)量隨著溫度的升高而顯著增加，在30 ℃的條件下培養(yǎng)5 d時(shí)孢子量達(dá)到最高，為24.2×105菌落·mL-1，其次是在30 ℃下培養(yǎng)3 d時(shí)，此時(shí)的孢子量也已經(jīng)為10.5×105菌落·mL-1。因此，確定30 ℃為菌株P(guān)T1液體發(fā)酵產(chǎn)孢的最適溫度，在此溫度下5 d為最適培養(yǎng)時(shí)間。由表1可見，在溫度為20 ℃情況下培養(yǎng)5 d時(shí)菌絲干質(zhì)量最大，為1.332 4 g，并且各個(gè)培養(yǎng)溫度下均在5 d時(shí)菌絲的干質(zhì)量達(dá)到最大。所以，對(duì)于以生產(chǎn)菌絲和孢子為主的生產(chǎn)中，可以選擇培養(yǎng)溫度分別20 ℃和30 ℃條件下培養(yǎng)5 d最為合適。

表1 溫度對(duì)PT1菌株孢子數(shù)量和菌絲干質(zhì)量的影響

2.2 最適初始pH的篩選

在不同初始pH條件下，PT1菌株的孢子產(chǎn)量和菌絲生物量見表2。由表2可知，在培養(yǎng)溫度分別為25 ℃和30 ℃時(shí)，孢子生產(chǎn)量的曲線較為一致，在酸性條件下(pH<7)都不利于PT1菌株產(chǎn)生孢子，在初始pH=3時(shí)均不產(chǎn)生孢子；但隨著pH值的上升，孢子量呈上升趨勢(shì)，分生孢子的數(shù)量都是在初始pH=11時(shí)達(dá)到最大，在25 ℃下為128.0×105菌落·mL-1，在30 ℃下為468.0×105菌落·mL-1。因此，對(duì)于以獲得孢子為目的的液體發(fā)酵生產(chǎn)中，菌株P(guān)T1在25、30 ℃的培養(yǎng)下，產(chǎn)生孢子的最適初始pH值都為11。但是，在30 ℃條件下的孢子產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于在25 ℃條件下的孢子產(chǎn)量，與2.1中的溫度測(cè)試結(jié)果相吻合。因此，在最適溫度30 ℃下設(shè)置初始pH為11時(shí)，可以有效地提高孢子的產(chǎn)量。

培養(yǎng)溫度分別為25 ℃和30 ℃的條件下，菌絲生物量曲線也較為一致，均在pH=9時(shí)菌絲的干質(zhì)量達(dá)到最大值，分別為0.672 4、0.774 3 g。因此，在以獲得菌絲為目的的液體發(fā)酵生產(chǎn)中，初始pH=9最為適宜。

2.3 最適供氧條件的篩選

在不同供氧條件下，PT1菌株在培養(yǎng)3、5、7 d時(shí)的孢子產(chǎn)量和菌絲生物量見表3。由表3可知，在25 ℃條件下，將150 mL PD培養(yǎng)液加入到500 mL三角瓶中，培養(yǎng)5 d孢子的產(chǎn)量最大，為24.0×105菌落·mL-1；在30 ℃條件下500 mL三角瓶中加入100 mL PD培養(yǎng)液，培養(yǎng)5 d孢子的產(chǎn)量最大，為235.0×105菌落·mL-1，在相同的條件下培養(yǎng)3 d后，孢子產(chǎn)量為143.0×105菌落·mL-1?？梢?，在30 ℃條件下的孢子產(chǎn)量遠(yuǎn)大于在25 ℃條件下的孢子產(chǎn)量。由此可以確定，PT1菌株在30 ℃條件下500 mL三角瓶中加入100 mL PD培養(yǎng)液，培養(yǎng)5 d產(chǎn)孢量達(dá)到最大值。

表2 初始pH值對(duì)PT1菌株孢子數(shù)量和菌絲干質(zhì)量的影響

培養(yǎng)溫度分別為25、30 ℃條件時(shí)，將200 mL PD培養(yǎng)液加入500 mL三角瓶中，培養(yǎng)7 d時(shí)菌絲干質(zhì)量達(dá)到最大值，分別為0.984 3、0.754 2 g。培養(yǎng)溫度25 ℃時(shí)的菌絲干質(zhì)量高于培養(yǎng)溫度30 ℃時(shí)的菌絲干質(zhì)量，可見，溫度較低有利于PT1菌株菌絲的積累，這與2.1中的溫度試驗(yàn)結(jié)果一致。因此，可以確定PT1菌株在25 ℃條件下500 mL三角瓶中加入200 mL PD培養(yǎng)液培養(yǎng)7 d后，菌絲的生物量積累達(dá)到最大值。

表3 供氧條件對(duì)PT1菌株孢子數(shù)量和菌絲干質(zhì)量的影響

2.4 最適接菌量的篩選

在不同接菌量條件下，PT1菌株在培養(yǎng)3、5、7 d時(shí)，孢子的產(chǎn)量和菌絲生物量的積累情況見表4。由表4可知，在25 ℃條件下初始接菌量為1.0 mL，培養(yǎng)時(shí)間為7 d時(shí)，孢子產(chǎn)量達(dá)到最大，為10.50×105菌落·mL-1。在30 ℃下初始接菌量為1.0 mL、培養(yǎng)7 d時(shí)，孢子數(shù)量達(dá)最大，為35.75×105菌落·mL-1；其次是在接菌量1.0 mL、培養(yǎng)5 d時(shí)，孢子產(chǎn)量達(dá)到23.20×105菌落·mL-1。由此可知，PT1菌株產(chǎn)孢最適宜的接菌量為，30 ℃條件下500 mL三角瓶中接菌1.0 mL。

在25 ℃條件下初始接菌量為1.5 mL，培養(yǎng)5 d時(shí)，菌絲干質(zhì)量達(dá)到最大值，為0.864 3 g。在30 ℃、初始接菌量為1.5 mL、培養(yǎng)5 d時(shí)，菌絲干質(zhì)量達(dá)到最大值，為0.972 8 g。由此可得，在初始接菌量為1.5 mL、培養(yǎng)5 d時(shí)，菌絲的生物量積累達(dá)到最大值。

表4 接菌量對(duì)PT1菌株孢子數(shù)量和菌絲干質(zhì)量的影響

3 結(jié)論與討論

淡紫擬青霉是土壤中常見的內(nèi)寄生真菌，是植物寄生線蟲的主要天敵，也是最重要的生防菌劑，多以活性孢子制劑投入到生產(chǎn)生活中。所以實(shí)現(xiàn)淡紫擬青霉孢子的大量生產(chǎn)在防治植物寄生線蟲方面有著重要的意義。在以往的研究中多以固體發(fā)酵產(chǎn)孢為主，如汪軍等以玉米、甘蔗渣、麩皮、殼聚糖制作復(fù)合培養(yǎng)基固體發(fā)酵淡紫擬青霉[7]；肖順等利用菌草和麩皮混合作為培養(yǎng)基來培養(yǎng)淡紫擬青霉[8]，固體發(fā)酵雖然有效但試驗(yàn)方法繁瑣，不利于大規(guī)模投入生產(chǎn)。梁照文等對(duì)該菌液體培養(yǎng)基進(jìn)行了比較[9]，但對(duì)液體發(fā)酵條件研究較少，不能滿足菌劑生產(chǎn)規(guī)模化的要求。為滿足淡紫擬青霉發(fā)酵低成本、高產(chǎn)量、大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的目的，本試驗(yàn)通過淡紫擬青霉液體發(fā)酵對(duì)不同的溫度、pH值、光照等環(huán)境因子對(duì)真菌孢子萌發(fā)和菌落生長(zhǎng)的影響進(jìn)行篩選。研究表明，在不同溫度條件下，菌株P(guān)T1孢子的產(chǎn)量隨著溫度的升高而顯著增加，在20～30 ℃均能生長(zhǎng)，在30 ℃條件下培養(yǎng)5 d孢子的產(chǎn)量達(dá)到最大值。在以往的報(bào)道中，在過酸或過堿的環(huán)境下都會(huì)抑制淡紫擬青霉孢子的產(chǎn)生。在本試驗(yàn)中PT1菌株在pH值小于8的條件下孢子的產(chǎn)量較少，當(dāng)pH=9時(shí)孢子產(chǎn)量增加，在pH=11時(shí)孢子產(chǎn)量達(dá)到峰值，繼續(xù)升高pH值后孢子產(chǎn)量逐漸下降。這與淡紫擬青霉E16菌株pH值為6～10產(chǎn)孢量較大的結(jié)果大為不同，可能是由于在特定情況下不同菌株的產(chǎn)孢條件也不盡相同。供氧條件對(duì)PT1菌株液體發(fā)酵產(chǎn)孢量的影響沒有溫度和pH值的影響作用大。但在30 ℃條件下培養(yǎng)5 d時(shí)，將100 mL PD培養(yǎng)液加入500 mL三角瓶對(duì)液體發(fā)酵產(chǎn)孢最為有利。不同的裝瓶量會(huì)使三角瓶中的通氣量和溶氧量不同，只有在最適宜的條件下微生物才可以達(dá)到孢子最高產(chǎn)量，而且從本試驗(yàn)中可以發(fā)現(xiàn)較高的溫度有利于PT1菌株提前達(dá)到產(chǎn)孢量的最大值。本試驗(yàn)中，PT1菌株產(chǎn)生孢子量最多時(shí)，供氧條件為，在30 ℃條件下將100 mL PD培養(yǎng)液加入到500 mL三角瓶，接菌量為1.0 mL。

在獲得高菌絲生物量方面本試驗(yàn)同樣從培養(yǎng)溫度、初始pH值、供氧條件和初始接菌量4個(gè)方面進(jìn)行了篩選。PT1菌株菌絲生產(chǎn)的最適宜條件為，培養(yǎng)溫度20 ℃、培養(yǎng)液的初始pH=9、供氧條件為將200 mL PD培養(yǎng)液加入到500 mL三角瓶中，當(dāng)500 mL三角瓶中裝有200 mL PD培養(yǎng)液時(shí)接菌量為1.5 mL,在以上條件都滿足的情況下培養(yǎng)5～7 d。

除培養(yǎng)溫度、初始pH值、供氧條件和初始接菌量的條件影響外，淡紫擬青霉菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢條件還受到營(yíng)養(yǎng)條件、無機(jī)鹽、微量元素等諸多因素的影響，有待進(jìn)一步的試驗(yàn)探究。本試驗(yàn)雖只是在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行的小規(guī)模試驗(yàn)，但對(duì)淡紫擬青霉大規(guī)模的液體發(fā)酵生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義，為淡紫擬青霉制劑的生產(chǎn)提供了一個(gè)新的途徑。

參 考 文 獻(xiàn)

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