李 焱，黃 葦，盧明劍，何穎詩，何子晴

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院，廣東 廣州 510642）

紫果西番蓮（Passiflora edulisSims）是西番蓮科西番蓮屬藤本植物，在我國云南、廣東、廣西等地大規(guī)模種植［1］，其果汁香味怡人，風(fēng)味獨(dú)特，在飲料市場(chǎng)上占有重要地位［2］。西番蓮果的種籽占整果質(zhì)量的11%左右，含油量約為20%，目前國內(nèi)外對(duì)西番蓮種籽利用的研究主要集中于籽油開發(fā)［3］。研究表明，紫果西番蓮籽含有維生素［4］、不飽和脂肪酸［5］、黃酮［6］等有效成分，而黃酮類化合物具有抗菌［7］、抗氧化自由基［8］、抗癌［9］等藥理活性，對(duì)人類疾病治療有很大的輔助作用。Oliveira等［10］研究發(fā)現(xiàn)，超聲輔助浸提黃果西番蓮種籽油粕得到的提取物含有黃酮，其具有體外抗氧化和抑菌活性。筆者也初步研究發(fā)現(xiàn)，紫果西番蓮種籽油粕中含有黃酮。但目前針對(duì)紫果西番蓮提取籽油后產(chǎn)生的副產(chǎn)物油粕的研究和利用鮮見報(bào)道。

黃酮廣泛存在于不同植物中，已有研究表明，廣東五華紫果西番蓮葉、菠蘿蜜種子、紅樹莓籽、黑苦蕎米的黃酮提取率分別為2.84、33.00、55.40、2.20 mg/g［11-14］。本課題組利用乙醇浸提法初步研究發(fā)現(xiàn)，西番蓮果實(shí)的不同部位均含黃酮，其中果皮角質(zhì)層含6.89 mg/g，果皮海綿層含4.82 mg/g，果汁含37.55 mg/g，種籽含70.04 mg/g，而取油后的種籽油粕中黃酮高達(dá)102.37 mg/g，極顯著高于西番蓮果實(shí)的其他部位以及其他一些植物，是天然黃酮的良好來源。紫果西番蓮種籽油粕黃酮的超聲微波雙輔助提取技術(shù)尚未見報(bào)道，本試驗(yàn)旨在建立一種紫果西番蓮種籽油粕黃酮的高效提取方法，將超聲波提取技術(shù)的振動(dòng)作用、空化效應(yīng)與微波提取技術(shù)的破壁、加熱作用相結(jié)合，提高黃酮提取率，增加紫果西番蓮種籽的綜合利用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試紫果西番蓮購自廣州市天平架市場(chǎng)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（分析純）購自中國藥品生物制品檢定所，無水乙醇、石油醚、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等，均為分析純。

儀器設(shè)備：FW100高速萬能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）、 AL204電子分析天平（梅斯特-托利多儀器有限公司）、UV-6300紫外可見分光光度儀（上海美普達(dá)儀器有限公司）、KQ-500DE三頻式超聲波處理機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）、IKA HB10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國艾卡儀器設(shè)備有限公司）、G70F20CN1LDG格蘭仕微波爐（青島海爾微波爐制品有限公司）、SOX406脂肪測(cè)定儀（濟(jì)南海能儀器股份有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 將紫果西番蓮取汁后，用清水漂洗種籽，種籽于55℃烘箱中烘干，粉碎，過孔徑0.425 mm篩。稱取干燥的種籽粉末適量，加入石油醚進(jìn)行脫脂（85℃冷凝回流70 min），于通風(fēng)櫥中揮干石油醚，收集脫脂后的種籽油粕備用。

1.2.2 油粕中黃酮的提取 稱取0.50 g油粕樣品放入錐形瓶中，設(shè)置超聲溫度80℃（冰水循環(huán)控溫），按照一定的料液比加入乙醇溶液于超聲波處理器中進(jìn)行超聲提取，然后置于微波處理器中提取。提取液以乙醇溶液定容，取上清液稀釋10倍測(cè)定黃酮含量。

1.2.3 黃酮含量的測(cè)定 參照文獻(xiàn)［15］采用硝酸鋁顯色法測(cè)定黃酮含量，試驗(yàn)得蘆丁質(zhì)量濃度（C，mg/mL）與吸光度（A）間的回歸方程：C= 0.0864A-7×10-5，r= 0.9995，計(jì)算待測(cè)樣品的黃酮提取率（T）：

式中，C為標(biāo)曲計(jì)算得出的黃酮質(zhì)量濃度（mg/mL），V為提取液定容體積（mL），n為稀釋倍數(shù)，m為樣品質(zhì)量（g），T為紫果西番蓮種籽油粕的黃酮提取率（以蘆丁計(jì)，mg/g）。

1.2.4 單因素試驗(yàn) 按1.2.2方法提取油粕黃酮，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲功率、超聲時(shí)間、微波功率和微波時(shí)間作為影響因素，考察各因素對(duì)黃酮提取率的影響，每個(gè)試驗(yàn)處理3次重復(fù)。

1.2.5 Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)中，超聲功率和微波時(shí)間只在一個(gè)較窄的范圍內(nèi)對(duì)黃酮提取率有較好的促進(jìn)作用，故根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，固定超聲功率為300 W，微波時(shí)間為90 s，選擇對(duì)黃酮提取率影響顯著的因子（乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時(shí)間和微波功率）進(jìn)行響應(yīng)面組合試驗(yàn)，試驗(yàn)自變量因素及水平設(shè)計(jì)見表1。

1.2.6 與乙醇浸提法比較 乙醇浸提法是常用的黃酮提取方法，參照文獻(xiàn)［16］選擇提取溫度80℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶20（g/mL）等條件，恒溫水浴浸提2.5 h，重復(fù)3次，測(cè)定并計(jì)算黃酮提取率。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)自變量因素水平

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design Expert 8.0軟件和Origin 9.0 Professional軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲微波雙輔助提取西番蓮油粕黃酮的單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮提取率的影響 固定料液比1∶30（g/mL）、超聲功率300 W、超聲時(shí)間20 min、微波功率160 W、微波時(shí)間90 s的條件下，考察乙醇體積分?jǐn)?shù) 50%、60%、70%、80%、90%對(duì)黃酮提取率的影響，結(jié)果（圖1）表明，在供試范圍內(nèi)，黃酮提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增大呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，提取率在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)達(dá)到峰值；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過80%時(shí)，黃酮提取率反而下降，這可能是乙醇體積分?jǐn)?shù)過高導(dǎo)致一些水溶性黃酮類化合物溶出量降低造成。故選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)80%較佳。黃酮溶出與溶劑極性有關(guān)，黃酮的極性與溶劑極性相似度越大，其溶出量越多［17］。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)西番蓮油粕黃酮提取率的影響

2.1.2 料液比對(duì)黃酮提取率的影響 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、超聲功率300 W、超聲時(shí)間20 min、微波功率160 W、微波時(shí)間90 s的條件下，考察料液比 1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）對(duì)黃酮提取率的影響，結(jié)果（圖2）表明，在料液比1∶20～50（g/mL）范圍內(nèi)，隨著料液比的比值下降，黃酮提取率明顯增加，這是由于溶劑用量增加會(huì)加大油粕和溶劑兩相間黃酮的濃度差，提高傳質(zhì)推動(dòng)力［18］，有助于黃酮溶出；隨著料液比的比值繼續(xù)下降，黃酮提取率呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，可能是因?yàn)槿軇┯昧窟^大，使加熱負(fù)荷增加，充分提取所需時(shí)間延長(zhǎng)，在本試驗(yàn)限定時(shí)間內(nèi)提取不完全，導(dǎo)致黃酮提取率降低。故選擇料液比1∶50（g/mL）較佳。

圖2 料液比對(duì)西番蓮油粕黃酮提取率的影響

2.1.3 超聲功率對(duì)黃酮提取率的影響 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、料液比1∶50（g/mL）、超聲時(shí)間20 min、微波功率160 W、微波時(shí)間90 s的條件下，考察超聲功率200、250、300、350、400、450、500 W對(duì)黃酮提取率的影響，結(jié)果（圖3）表明，超聲功率在200～300 W范圍內(nèi)，隨著超聲功率增大，黃酮提取率逐漸升高，這是因?yàn)樵龃蟪暪β始訌?qiáng)了細(xì)胞內(nèi)分子運(yùn)動(dòng)，細(xì)胞內(nèi)水分子氣化產(chǎn)生的壓力使細(xì)胞壁破碎，有利于黃酮溶出［19］；當(dāng)超聲功率為300 W時(shí)，提取率達(dá)到峰值，之后增大超聲功率，機(jī)械效應(yīng)增強(qiáng)，蛋白質(zhì)分子中的氫鍵被破壞發(fā)生物理變性，可溶性蛋白質(zhì)溶出變性導(dǎo)致溶液粘度增大，使得空化效應(yīng)減弱，不利于細(xì)胞破裂，從而導(dǎo)致黃酮提取率降低［20］。故選擇超聲功率300 W較佳。

圖3 超聲功率對(duì)西番蓮油粕黃酮提取率的影響

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、料液比1∶50（g/mL）、超聲功率300 W、微波功率160 W、微波時(shí)間90 s的條件下，考察超聲時(shí)間 10、20、30、40、50、60 min對(duì)黃酮提取率的影響，結(jié)果（圖4）表明，黃酮提取率隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，當(dāng)超聲時(shí)間大于30 min時(shí)，提取率增加緩慢，因?yàn)橛行С煞衷诔曁幚?0 min后已大部分溶出，繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間，對(duì)提升黃酮提取率影響微弱。故選擇超聲時(shí)間30 min為宜。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)西番蓮油粕黃酮提取率的影響

2.1.5 微波功率對(duì)黃酮提取率的影響 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、料液比1∶50（g/mL）、超聲功率300 W、超聲時(shí)間30 min、微波時(shí)間90 s的條件下，考察微波功率160、240、320、400、480 W對(duì)黃酮提取率的影響，結(jié)果（圖5）表明，隨著微波功率的增大，黃酮提取率呈先升高后降低的趨勢(shì)，在微波功率為160 W時(shí)，提取率達(dá)到最大。這是由于在一定范圍內(nèi)增大微波功率，細(xì)胞內(nèi)的水分子吸收微波能，產(chǎn)生大量的熱量，胞內(nèi)溫度迅速上升，水分子氣化將細(xì)胞壁沖破，有利于黃酮溶出［21］；但進(jìn)一步提高功率，會(huì)導(dǎo)致體系溫度過高，乙醇揮發(fā)導(dǎo)致其體積分?jǐn)?shù)降低，黃酮提取不完全，從而降低了黃酮提取率［22］。故選擇微波功率320 W最佳。

平衡時(shí)油壓分布如圖8所示，可以看出，平衡時(shí)油槽大部分位于油膜擴(kuò)散區(qū)，對(duì)油膜收斂區(qū)油壓分布影響較小，此時(shí)收斂區(qū)油壓分布規(guī)律接近軸瓦無槽時(shí)油壓分布。

圖5 微波功率對(duì)西番蓮油粕黃酮提取率的影響

2.1.6 微波時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、料液比1∶50（g/mL）、超聲功率300 W、超聲時(shí)間30 min、微波功率320 W的條件下，考察微波時(shí)間30、60、90、120、150 s對(duì)黃酮提取率的影響，結(jié)果（圖6）表明，隨著微波時(shí)間的延長(zhǎng)，黃酮提取率逐漸增大，當(dāng)微波時(shí)間為90 s時(shí)達(dá)到最大值。進(jìn)一步延長(zhǎng)微波時(shí)間，黃酮提取率反而下降。這可能是因?yàn)槔^續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間，細(xì)胞內(nèi)的極性物質(zhì)吸收大量微波能，產(chǎn)生的熱量導(dǎo)致體系溫度過高，乙醇揮發(fā)導(dǎo)致其體積分?jǐn)?shù)降低，黃酮提取不完全，從而降低了黃酮提取率［20］。故選擇微波時(shí)間為90 s較佳。

圖6 微波時(shí)間對(duì)西番蓮油粕黃酮提取率的影響

2.2 響應(yīng)面組合試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果 以黃酮提取率為響應(yīng)值，從上述單因素試驗(yàn)中，選取對(duì)黃酮提取率影響更為顯著的乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、超聲時(shí)間（C）、微波功率（D）為自變量，建立四因素三水平中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。Box-Behnken設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

2.2.2 回歸方程擬合及方差分析 對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程為：Y= 98.43- 7.71A + 5.85B + 20.79C - 4.84D + 0.82AB +2.18AC + 3.73AD + 3.38BC - 1.10BD - 7.00CD -10.27A2- 5.80B2- 8.36C2- 9.03D2，R2= 0.9837，R2adj= 0.9674。再對(duì)該模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，得出二次響應(yīng)回歸模型的方差分析結(jié)果見表3。

從表3的F值可知，各因素對(duì)紫果西番蓮種籽油粕黃酮提取率的影響次序?yàn)椋撼晻r(shí)間C＞乙醇體積分?jǐn)?shù)A＞料液比B＞微波功率D。一次項(xiàng) A、B、C、D，二次項(xiàng) A2、B2、C2、D2以及交互項(xiàng)CD對(duì)油粕黃酮提取率的影響達(dá)到了極顯著水平，交互項(xiàng)AD、BC對(duì)油粕黃酮提取率的影響達(dá)到了顯著水平，其余項(xiàng)不顯著。

由表3方差分析可知，回歸模型達(dá)到極顯著水平，說明該方法可靠；失擬項(xiàng)不顯著，說明方程對(duì)該試驗(yàn)擬合程度良好；其回歸決定系數(shù)R2= 0.9837，說明有98.37%的響應(yīng)值符合此模型；校正決定系數(shù)R2adj= 0.9674，模型能解釋96.74%由乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時(shí)間、微波功率等試驗(yàn)因素引起的響應(yīng)值變化；變異系數(shù)（CV）為3.68%，說明模型的重現(xiàn)性較好。綜上所述，可用該模型進(jìn)行紫果西番蓮種籽油粕黃酮提取率的分析與預(yù)測(cè)。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.3 響應(yīng)面圖分析 響應(yīng)面曲面越陡峭，對(duì)應(yīng)的因素對(duì)響應(yīng)值的影響越大。等高線圖越接近圓形，兩因素之間的交互作用越弱；反之，則兩因素之間的交互作用越強(qiáng)［23］。

表3 二次響應(yīng)模型方差分析

2.2.4 最佳提取工藝參數(shù)及驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 通過Design Expert 8.0軟件分析得出最佳工藝參數(shù)為：乙醇體積分?jǐn)?shù)73.78%、料液比1∶56.02（g/mL）、超聲時(shí)間50 min、微波功率160 W，此條件下預(yù)測(cè)黃酮提取率為119.262 mg/g。以此條件進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得黃酮提取率均值為117.53 mg/g，與預(yù)測(cè)值相比，相對(duì)誤差為0.17%，說明可以用該模型優(yōu)化的參數(shù)進(jìn)行紫果西番蓮種籽油粕黃酮的提取。

2.3 與乙醇浸提法比較結(jié)果

采用乙醇浸提法提取黃酮，浸提時(shí)間為2.5 h，提取率均值為102.37 mg/g；超聲微波雙輔助提取法的黃酮提取率可達(dá)到117.53 mg/g，較乙醇浸提法高14.81%，且提取時(shí)間僅為50 min，是乙醇浸提法的1/3?？梢姡曃⒉p輔助法具有高效、省時(shí)的特點(diǎn)。

3 結(jié)論與討論

本研究通過單因素試驗(yàn)分別考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲功率、超聲時(shí)間、微波功率、微波時(shí)間對(duì)西番蓮種籽油粕黃酮提取率的影響，其中乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率、微波功率、微波時(shí)間等單因素處理，隨著自變量的增大黃酮提取率呈現(xiàn)先升高，達(dá)到峰值后下降的趨勢(shì)；黃酮提取率隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升高后趨平的趨勢(shì)；黃酮提取率隨著料液比的下降呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。各單因素對(duì)黃酮提取率影響順序?yàn)槌晻r(shí)間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞料液比＞微波功率＞超聲功率＞微波時(shí)間。

圖7 兩因素交互作用對(duì)黃酮提取率影響的響應(yīng)面和等高線

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時(shí)間、微波功率為考察因素，利用響應(yīng)面分析法建立了優(yōu)化超聲波、微波雙輔助提取紫果西番蓮種籽油粕黃酮工藝條件的二次回歸方程模型，經(jīng)驗(yàn)證，該模型可靠，其方差分析結(jié)果表明各單因素對(duì)黃酮提取率影響順序?yàn)槌晻r(shí)間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞料液比＞微波功率，超聲時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、微波功率以及交互項(xiàng)中超聲時(shí)間和微波功率的交互作用對(duì)黃酮提取率影響極顯著，乙醇體積分?jǐn)?shù)和微波功率的交互作用、料液比和超聲時(shí)間的交互作用對(duì)油粕黃酮提取率影響顯著。根據(jù)模型確定最優(yōu)工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)73.78%、料液比1∶56.02（g/mL）、超聲功率300 W、超聲時(shí)間50 min、微波功率160 W、微波時(shí)間90 s，該條件下黃酮提取率為117.53 mg/g，比乙醇浸提法黃酮提取率高14.81%。超聲和微波輔助提取技術(shù)廣泛應(yīng)用于植物活性成分的提取，超聲微波雙輔助法是提取紫果西番蓮種籽油粕黃酮的一種高效方法，其將超聲波提取技術(shù)的振動(dòng)作用、空化效應(yīng)與微波提取技術(shù)的破壁、加熱作用相結(jié)合，使細(xì)胞壁加速破裂并提高黃酮提取率，但種籽油粕黃酮的純化、結(jié)構(gòu)鑒定及生物活性仍需進(jìn)一步深入研究。

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