舒曉夢(mèng)，趙素娟，王羚佳，郭登峰，陳祥貴，楊瀟，羅靜

(西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都，610039)

乙氧基喹啉又稱乙氧喹啉、山道喹、虎皮靈、防老劑AW、抗氧喹、乙氧喹，化學(xué)名稱：6-乙氧基-1，2-二氫化-2，2，4-三甲基喹啉(6-ethoxy-1,2-dihydro-2,2,4-trimethylquinoline，EQ)。英文名：ethoxyquin，相對(duì)分子質(zhì)量：217.31。它具有較強(qiáng)的防霉和保鮮作用，可防止脂肪、蛋白質(zhì)飼料在貯存過程中變質(zhì)，常被用于蘋果、梨等水果的保鮮；另外，它具有較強(qiáng)的抗氧化作用，是目前動(dòng)物飼料中應(yīng)用廣泛、效果好而又經(jīng)濟(jì)的抗氧化添加劑[1-3]。

二聚乙氧基喹啉，化學(xué)名稱：8-(6-乙氧基-2,2,4-三甲基-1,2-二氫-1-喹啉基)-6-乙氧基-2,2,4三甲基-1,2-二氫喹啉，英文名：ethoxyquin dimer(EQDM)，相對(duì)分子質(zhì)量：432.59，該品為乙氧基喹啉在生物體內(nèi)的主要代謝物[4-6]，其在生物體中的含量與喂入生物體乙氧基喹啉的量有關(guān)[7]，且有較好的穩(wěn)定性[5]。

由于對(duì)EQ的毒理性質(zhì)已有清楚的了解，目前國內(nèi)外對(duì)食品中EQ的限量值已有明確的規(guī)定[8-9]，也建立了針對(duì)EQ的檢測(cè)方法[10-14]。但是EQ的主要代謝產(chǎn)物EQDM的潛在毒性目前尚不清楚，有研究對(duì)EQDM第一階段和第二階段生物轉(zhuǎn)化酶的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)進(jìn)行了模擬，發(fā)現(xiàn)在相同的酶系統(tǒng)上，EQDM的生物轉(zhuǎn)化與母體化合物(EQ)的生物轉(zhuǎn)化相當(dāng)，能激活相同的酶體系[15-17]。由于EQDM的穩(wěn)定性比EQ更好[5]，可能產(chǎn)生更高的殘留量，因而可能存在安全風(fēng)險(xiǎn)。但目前的研究中對(duì)于EQDM的檢測(cè)方法卻鮮有報(bào)道。

在本研究中通過優(yōu)化樣品前處理方法和液相分析檢測(cè)條件建立了同時(shí)檢測(cè)豬肉中EQ及其代謝產(chǎn)物EQDM的高效液相熒光法。經(jīng)方法學(xué)評(píng)價(jià)，該方法具有較好的精密度和準(zhǔn)確性。本研究的結(jié)果可以為EQDM的代謝過程、毒理學(xué)性質(zhì)研究，以及EQ和EQDM在豬肉中殘留量的監(jiān)測(cè)提供有效的分析檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉，市售；正己烷、丙酮、乙酸(色譜純)、乙腈(色譜純)，購自美國Tedia公司；EQ標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%)，EQDM標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%)，購自上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC20高效液相色譜儀(帶熒光檢測(cè)器)，日本島津公司；RF6000熒光分光光度計(jì)，日本島津公司；TB-214電子天平型，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；MS3組織勻漿機(jī)，德國IKA公司；BZF-50真空干燥箱，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；微型攪拌器、超聲波清洗儀，中國玉環(huán)曙峰企業(yè)。

1.3 樣品的前處理方法

稱取一定量的樣品，用濾紙吸干表面水分，組織勻漿機(jī)勻漿后稱取5.000 g的樣品，于50 mL具塞離心管中，加入15 mL正己烷，30 ℃超聲提取10 min，4 ℃ 5 000 r/mim離心10 min，提取10 mL上清液30 ℃真空干燥至近干，再加入1 mL乙腈溶解，并經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，待測(cè)。

1.4 HPLC分析測(cè)試條件

色譜柱: Kromasil C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；檢測(cè)器：熒光檢測(cè)器，激發(fā)波長：360 nm，吸收波長：440 nm；流動(dòng)相：V(乙腈)∶V(2%乙酸)=85∶15，柱溫為30 ℃；流速1 mL/min；進(jìn)樣量:20 μL。

1.5 樣品中EQ和EQDM含量的定量分析

以EQ和EQDM的保留時(shí)間(RTEQ：5.86 min、RTEQDM：32.44 min)定性。以外標(biāo)法定量，分別以各標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積及對(duì)應(yīng)質(zhì)量建立標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程，再根據(jù)樣品中EQ和EQDM的峰面積，按下式計(jì)算樣品中EQ和EQDM的含量：

(1)

(2)

式中：CEQ,樣品中EQ的含量，μg/g；CEQDM,樣品中EQDM的含量，μg/g；MEQ,20 μL樣品液中EQ的含量，μg；MEQDM,20 μL樣品液中EQDM的含量，μg；20,樣品進(jìn)樣體積20 μL；1 000,樣品提取液揮干后定容至1 000 μL；15,提取液體積，mL；10,移取10 mL提取液上清進(jìn)行真空干燥，mL；MS,取樣量，g。

1.6 EQ、EQDM檢測(cè)方法的條件優(yōu)化與評(píng)價(jià)

1.6.1 色譜分離檢測(cè)條件的優(yōu)化

根據(jù)EQ、EQDM標(biāo)準(zhǔn)品的熒光光譜選擇適合的激發(fā)和發(fā)射波長，并在該條件下比較不同比例流動(dòng)相、流速和柱溫的對(duì)EQ、EQDM的分離效果，從而篩選出適合的色譜分離條件。

1.6.2 EQ、EQDM的前處理優(yōu)化

為優(yōu)化樣品破碎方法，對(duì)樣品分別采用勻漿機(jī)破碎和液氮研磨兩種破碎方法進(jìn)行處理。為優(yōu)化提取溶劑種類，分別采用丙酮、乙腈、正己烷對(duì)EQ、EQDM進(jìn)行提取。通過比較提取液中EQ、EQDM的加標(biāo)回收率和RSD值，從而選擇適合的樣品破碎方法和提取溶劑。

1.6.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

為評(píng)價(jià)該方法的重現(xiàn)性，取5份加標(biāo)平行樣品，根據(jù)樣品處理和檢測(cè)條件測(cè)定EQ、EQDM的含量，分別計(jì)算其RSD值。為評(píng)價(jià)方法的穩(wěn)定性，將5份加標(biāo)樣品按上述樣品提取后分別放置0、3、6、9、12 h后檢測(cè)，分別計(jì)算其RSD值，考察其穩(wěn)定性。為評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確度，在樣品中分別加入0.012、0.036、0.060 μg EQ和0.045、0.075、0.096 μg EQDM標(biāo)準(zhǔn)品，按本研究所確定的樣品前處理方法和檢測(cè)條件，對(duì)每個(gè)加標(biāo)濃度樣品進(jìn)行5次平行試驗(yàn)，計(jì)算其加標(biāo)回收率和RSD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 EQ、EQDM最適檢測(cè)條件優(yōu)化

在已有研究的基礎(chǔ)上確定EQ、EQDM的最適的激發(fā)和發(fā)射波長[18-19]，設(shè)置激發(fā)波長為360 nm時(shí)，在發(fā)射波長400～500 nm檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)EQ和EQDM在440 nm處均有最大的熒光強(qiáng)度；設(shè)置發(fā)射波長為440 nm時(shí)，在激發(fā)波長250～500 nm，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)EQ和EQDM在360 nm處有較大的熒光強(qiáng)度(如圖1)。因此，將熒光檢測(cè)器的檢測(cè)條件設(shè)置為：激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長440 nm。

2.2 色譜分離檢測(cè)條件優(yōu)化

通過比較不同比例流動(dòng)相、柱溫的分離效果，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相：V(乙腈)∶V(2%乙酸)=85∶15、柱溫：30 ℃、流速：1 mL/min時(shí)，目標(biāo)化合物的柱效(大于2 000)和分離度(大于2.5)較高，同時(shí)EQ的保留時(shí)間:5.86 min，EQDM的保留時(shí)間:32.44 min，對(duì)樣品的分析時(shí)間在35 min完成、基線平穩(wěn)、噪音小、峰形尖銳對(duì)稱并無拖尾現(xiàn)象,如圖2所示。

2.3 方法的線性范圍和定量限

用流動(dòng)相V(乙腈)∶V(2%乙酸)=85∶15配制濃度為8×10-3μg/mL的EQ標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣20、40、60、80、100 μL，對(duì)應(yīng)EQ質(zhì)量為：16×10-5、32×10-5、48×10-5、64×10-5、80×10-5μg；配制質(zhì)量濃度為0.01 μg /mL的EQDM標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣60、80、100、120、140 μL，對(duì)應(yīng)EQDM質(zhì)量為：0.6×10-3、0.8×10-3、1.0×10-3、1.2×10-3、1.4×10-3μg。按照1.4中的色譜條件進(jìn)行分析，以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)作圖，建立線性回歸方程。所得EQ回歸方程為：Y=604.27X-8 446,R2=0.998 6；EQDM回歸方程為：Y=1 425.3X-6 140.8,R2=0.997 6。結(jié)果表明：EQ在16×10-5～80×10-5μg內(nèi)，EQDM在0.6×10-3～1.4×10-3μg內(nèi)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均高于0.99。以10倍信噪比(S/N)計(jì)算定量限，根據(jù)計(jì)算公式該方法的定量限(LOQ)EQ為0.002 4 μg/g，EQDM為0.009 μg/g。

a-激發(fā)波長為360 nm時(shí)，EQ的發(fā)射光譜； b-發(fā)射波長為440 nm時(shí)，EQ的激發(fā)光譜； c-激發(fā)波長為360 nm時(shí)，EQDM的發(fā)射光譜； d-發(fā)射波長為440 nm時(shí)，EQDM的激發(fā)光譜。圖1 EQ和EQDM的熒光光譜Fig.1 The fluorescence spectra of EQ and EQDM

a-EQ和EQDM混合標(biāo)品色譜圖;b-加標(biāo)樣品色譜圖圖2 色譜分離檢測(cè)條件優(yōu)化Fig.2 Optimization of chromatography separation and detection conditions

2.4 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

不同的破碎方法下,樣品中EQ、EQDM提取效果有一定的差異。經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采用勻漿機(jī)破碎時(shí)能很好的破碎肌肉組織，EQ、EQDM的回收率相對(duì)較高且RSD值較小(見表1)。而采用液氮研磨時(shí)，樣品容易結(jié)冰，不能很好的破碎組織 。這可能是由于目標(biāo)化合物的含量較小,需要較大的樣品取樣量，且肌肉組織中含有較多的水分易結(jié)冰，反而不利于組織充分破碎。因此選用組織勻漿機(jī)進(jìn)行樣品破碎。

表1 不同破碎方法下EQ、EQDM平均回收率和RSD值Table 1 The average recovery rate and RSD of EQ andEQDM were compared with different crushing methods

由于EQ和EQDM屬于弱極性化合物,不溶于水，易溶于有機(jī)溶劑[20-22]，分別采用乙腈、正己烷、丙酮進(jìn)行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)回收率：正己烷>丙酮>乙腈(見表2)，且RSD值小于5%，雜峰和基線噪音均較小。故選擇正己烷作為提取溶劑。

表2 不同提取方法下EQ、EQDM平均回收率和RSD值Table 2 The average recovery rate of EQ and EQDM andRSD value were obtained by different extraction methods

2.5 方法的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

取同加標(biāo)樣品提取液共5份，分別進(jìn)樣后，根據(jù)EQ、EQDM的峰面積計(jì)算的RSD值分別為2.44%、3.55%，RSD值均小于5%，表明該方法的重現(xiàn)性良好；同時(shí)將5份加標(biāo)樣品分別放置0、3、6、9、12 h后，分別測(cè)定EQ、EQDM峰面積的RSD值為3.61%、4.06%，RSD值均小于5%，由此表明該方法的穩(wěn)定性良好。

2.6 方法的加標(biāo)回收率、精密度和檢出限

在加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)中，通過來自加標(biāo)的豬肉樣品的分析物回收率來評(píng)估該檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性。在5.000 g樣品中按照低、中、高3個(gè)濃度加入EQ和EQDM標(biāo)準(zhǔn)溶液，即：分別加入0.012、0.036、0.060 μg EQ標(biāo)準(zhǔn)液以及0.045、0.075、0.096 μg EQDM標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，按本研究所確定的EQ、EQDM的最佳前處理方法和檢測(cè)條件，對(duì)每個(gè)加標(biāo)濃度樣品進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，并計(jì)算EQ、EQDM的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果(見表3)。該方法對(duì)EQ的平均回收率為93.88%～107.18%，EQDM的回收率為80.74%～83.62%，RSD均小于2%。以3倍信噪比(S/N)計(jì)算檢出限，根據(jù)計(jì)算公式該方法的檢出限(LOD)EQ為0.000 8 μg/g，EQDM為0.003 μg/g。說明該方法的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性好，檢出限低，符合殘留分析要求,能夠滿足檢測(cè)豬肉樣品中EQ、EQDM含量的要求。

表3 EQ和EQDM回收率和RSD值表Table3 EQ and EQDM Recovery rate and RSD

2.7 樣品檢測(cè)

采用此方法對(duì)多批次市售豬肉進(jìn)行抽樣檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明，此次抽取的樣品均未檢出EQ及其代謝產(chǎn)物EQDM。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了采用HPLC—熒光法測(cè)定豬肉中乙氧基喹啉以及代謝產(chǎn)物二聚乙氧基喹啉殘留量的方法。該方法具有操作簡單、選擇性好、背景干擾小的特點(diǎn)，對(duì)儀器要求不高，重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度都較好，檢出限和定量限較低，滿足豬肉中EQ、EQDM殘留量檢測(cè)的需求。

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