崔美林，蘇玉芳，高紅

(山西師范大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，山西 臨汾，041000)

小米(Setariautalica(L.) Beauv)屬禾本科(Gramineae)狗尾草屬(Setaria)植物，古稱粟，即為谷子去皮后的成分。小米具有很高的營養(yǎng)價(jià)值[1-4]。《本草綱目》記載指出“粟米氣味咸，微寒無毒，主治養(yǎng)胃氣，祛脾胃中熱、益氣，陳者苦寒，治胃熱消渴，利小便”[5]?，F(xiàn)代研究也發(fā)現(xiàn)，小米具有抗腫瘤、抗氧化、降低膽固醇水平、預(yù)防心血管系統(tǒng)疾病、調(diào)節(jié)激素水平等藥理作用[6-9]。

黃酮類化合物(flavonoids)是一類廣泛存在于自然界的多酚類化合物，有重要的藥理活性，具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤及降血壓等作用[10]。雙水相萃取技術(shù)作為一種新型的分離技術(shù)應(yīng)用愈加廣泛，與常規(guī)提取方法相比較，其具有操作條件溫和、提取時(shí)間短、能耗低、被分離物質(zhì)純度高等優(yōu)點(diǎn)[11-13]，已被應(yīng)用于蛋白質(zhì)、核酸、抗生素、黃酮等多種物質(zhì)的分離與提純[14-16]。

本實(shí)驗(yàn)以優(yōu)質(zhì)黃小米“沁州黃”為原料，研究了超聲輔助丙酮/硫酸銨雙水相體系中，小米籽粒中總黃酮的提取。同時(shí)，研究了不同的加工方式對(duì)小米中黃酮的影響，以期為小米日常加工提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山西“沁州黃”小米，市售。

蘆丁(純度≥98%)，成都曼思特生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，東京化成工業(yè)株式會(huì)社；無水乙醇、NaNO2、NaOH、(NH4)2SO4、丙酮、三氯乙酸、FeSO4、鐵氰化鉀、Al(NO3)3等,均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司；JA26038電子天平，上海精科天美儀器有限公司；752N紫外可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；臺(tái)式電動(dòng)平衡離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；DGX-90973B-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇榮華儀器制造有限公司；CP214電子天平，上海聯(lián)合有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黃酮含量測定方法

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。黃酮含量測定采用硝酸鋁顯色法[17-18]，吸取上相樣品溶液1.0 mL，加入質(zhì)量濃度為50 g/L NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，靜置 6 min，加入質(zhì)量濃度為100 g/L Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻，靜置 6 min，加入質(zhì)量濃度為40 g/L NaOH溶液4.0 mL，用體積分?jǐn)?shù)為30%乙醇定容至10.0 mL，搖勻，靜置15 min，以試劑空白作對(duì)照，在510 nm處測定吸光值，并計(jì)算樣品中黃酮含量，如式(1)所示。

(1)

式中：x，測定吸光值所對(duì)應(yīng)的蘆丁含量，mg/mL；V，上相總體積，mL；W，稱取的樣品質(zhì)量，g。

1.3.2 原料處理

將實(shí)驗(yàn)所用小米除雜、篩選去除霉變顆粒，低溫下冷藏備用，實(shí)驗(yàn)前取出將其研磨成粉末，全粉過100目篩。

1.3.3 丙酮/(NH4)2SO4雙水相體系相圖的繪制

丙酮 /(NH4)2SO4雙水相體系相圖采用濁點(diǎn)滴定法測定并繪制[13, 19]。精確稱取定量(NH4)2SO4(m1)，加入定量去離子水(m2)配制成一定濃度的鹽溶液，然后緩慢滴入丙酮，并不斷振蕩使其充分混合，直至試管內(nèi)液體出現(xiàn)渾濁，記錄加入丙酮的質(zhì)量(ma)，再次加入一定量去離子水(mw)，至溶液澄清；再次向試管中加丙酮至出現(xiàn)渾濁。重復(fù)此步驟，計(jì)算每次達(dá)到渾濁時(shí)，丙酮和(NH4)2SO4在系統(tǒng)總量中所占的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并以丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)，(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)繪制相圖。

1.3.4 超聲輔助雙水相提取小米黃酮的優(yōu)化試驗(yàn)

1.3.4.1 超聲輔助雙水相提取小米黃酮單因素試驗(yàn)

配制系統(tǒng)總量為20 g，分別量取一定量的丙酮、(NH4)2SO4溶液與一定質(zhì)量的水混勻、靜置，使體系中丙酮與(NH4)2SO4溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別占33%、17%。待溶液分相完全后記錄上相體積，加入1.0 g小米，于25 ℃，420 W超聲提取10 min，分析上相中小米黃酮含量。

在單因素試驗(yàn)中，在控制其他變量不變的情況下，分別考察了丙酮在雙水相體系中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(19%、23%、27%、31%、35%)，(NH4)2SO4溶液在雙水相體系中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(7%、12%、17%、22%、27%)，料液比(g∶mL)(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60)，超聲時(shí)間(10、20、30、40、50 min)及超聲溫度(25、30、35、40、45 ℃)對(duì)小米黃酮提取的影響。

1.3.4.2 超聲輔助雙水相提取小米黃酮的正交優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取適當(dāng)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化，采用L9(34)正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn)，確定最佳的提取工藝。

1.3.5 不同加工方法對(duì)小米黃酮提取量的影響

將小米原料除雜，稱取同等重量的小米進(jìn)行如下處理，研究不同加工方法(煮、蒸、燜、炒)對(duì)小米黃酮提取量的影響。

煮：將鍋中的水加熱至沸騰，取盛好的小米置于鍋中加熱煮制，分別在煮制10、15、20、25、30 min時(shí)取出適量小米樣品置于潔凈的盤中。

蒸：將鍋中的水加熱至沸騰，取盛好的小米置于鋪有紗布的蒸籠內(nèi)蒸制，分別在蒸制10、15、20、25、30 min時(shí)取出適量小米樣品置于潔凈的盤中。

燜：將鍋內(nèi)的水加熱至沸騰后將小米倒入鍋內(nèi)，使水淹小米二指，調(diào)節(jié)電磁爐功率，先急火煮10 min后弱火燜，分別在燜制10、15、20、25、30 min時(shí)取出適量小米樣品置于潔凈的盤中。

炒：在鍋內(nèi)加適量油燒至五成熟，放入蒸過10 min的小米在100 W電磁功率下翻炒，在1，2，3，4，5 min時(shí)取出適量小米樣品置于潔凈的盤中。

將以上各組處理后的小米樣品于60 ℃烘干至恒重后取出，研磨成小米粉末，測定黃酮含量。

1.3.6 小米黃酮提取物的抗氧化活性研究

1.3.6.1 小米黃酮對(duì)羥基自由基的清除能力

清除羥自由基能力的測定參照結(jié)晶紫法[20]。則羥自由基的產(chǎn)生量可由式(2)表示，表觀抗羥自由基氧化率S可由式(3)表示。

羥自由基產(chǎn)生量ΔA=A0-Ab

(2)

(3)

式中：A0，加H2O2溶液時(shí)580 nm處吸光值；Ab，結(jié)晶紫法反應(yīng)完成后580 nm處吸光度值；AS，在上述體系中加H2O2溶液之前添加0.5 mL小米黃酮提取液，測定吸光值。

1.3.6.2 DPPH自由基清除能力的測定

DPPH自由基清除能力測定參照徐雅琴[21]、BANGOURA等[22]方法，清除率(%)計(jì)算方法如下：

(4)

式中：Ai，2 mL DPPH溶液+2 mL樣品溶液；Aj，2 mL無水乙醇溶液+2 mL樣品溶液；A0，2 mL DPPH溶液+2 mL無水乙醇溶液。

1.3.6.3 鐵還原力測定

鐵還原力測定參照鐵氰化鉀法，以吸光值表征鐵還原能力，吸光值越高表明還原力越強(qiáng)[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 丙酮/硫酸銨雙水相相圖的分析

雙水相形成的條件和定量關(guān)系可用相圖進(jìn)行分析，雙節(jié)線將相圖劃分為上下兩相，上相富含丙酮，下相富含(NH4)2SO4(見圖1)。

圖1 丙酮/硫酸銨雙水相體系相圖Fig.1 The diagram of aqueous two-phase system with acetone/(NH4)2SO4

如圖1所示，加入丙酮的量越大，當(dāng)其分相時(shí)所需(NH4)2SO4的量就越小；反之，若體系中的(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，分相時(shí)所需的丙酮的量就越低。同時(shí)，當(dāng)(NH4)2SO4在體系中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為固定值時(shí)，丙酮在體系中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)須高于曲線所對(duì)應(yīng)值才能保證雙水相形成。因此，所采用的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)應(yīng)從曲線上方的區(qū)域選取，且體系中丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)與(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)需相互協(xié)調(diào)。

2.2 超聲輔助雙水相提取小米黃酮單因素實(shí)驗(yàn)分析

在單因素試驗(yàn)中，在控制其他變量不變的情況下，分別考察了丙酮，(NH4)2SO4溶液在雙水相體系中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間、超聲溫度及料液比對(duì)小米黃酮提取的影響(見圖2)。

如圖2-(a)所示，丙酮在體系中質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增大時(shí)，小米黃酮含量隨之上升。主要是由于隨著丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，黃酮更易增溶至上相，且丙酮締結(jié)水分子能力增強(qiáng)，下相中更多的水分被競爭吸附至上相，對(duì)黃酮具有更強(qiáng)的萃取能力，當(dāng)丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到31%時(shí)，黃酮含量可達(dá)(6.33±0.45) mg/g。但隨著丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加，更多的水分增溶到上相，(NH4)2SO4體積快速減小，體系開始變的不穩(wěn)定，可能引起(NH4)2SO4結(jié)晶析出，使得黃酮含量增勢減弱[24]。因此，考慮到成本問題，本試驗(yàn)選擇丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為31%。如圖2-(b)所示，當(dāng)(NH4)2SO4在雙水相體系中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在7%～17%時(shí)，隨著(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，小米黃酮提取量也隨之增高[25]，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17%時(shí)，小米黃酮含量達(dá)到最高，為(6.88±0.51) mg/g。但是(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加時(shí)，黃酮含量反而降低?？赡苁且?yàn)殡S著(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，下相締合水的能力增強(qiáng)，上相中的水減小，導(dǎo)致上相中的丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，小米黃酮更易增溶到上相中，但由于上相體積變小，增溶的小米黃酮的量有限，黃酮會(huì)向下相遷移，故黃酮提取量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。因此，確定(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)以17%為宜。

圖2 超聲輔助雙水相提取小米黃酮單因素實(shí)驗(yàn)分析Fig.2 The single factor experiment analyse of the extraction of millet flavonoids with ultrasonic-assisted aqueous two- phase system

由圖2-(c)可知，隨著提取溫度的升高，小米黃酮提取量逐漸增加，當(dāng)溫度為35 ℃時(shí)，黃酮含量達(dá)到最高，為(7.79±0.45) mg/g。分析原因，可能是因?yàn)楫?dāng)超聲溫度較低時(shí)，黃酮不能完全溶出，隨著溫度升高，提取液擴(kuò)散系數(shù)增加，促使傳質(zhì)速度加快，浸提更徹底。但是當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，(NH4)2SO4在水中的溶解度增大，上相鹽向下相富集，從而導(dǎo)致上相溶液極性改變，不利于黃酮溶出。因此，確定超聲波提取溫度以35℃為宜。由圖2-(d)可知，當(dāng)超聲時(shí)間為10～30 min時(shí)，小米黃酮提取量逐漸增高，并隨時(shí)間繼續(xù)延長而顯著降低。超聲時(shí)間過長時(shí)可能會(huì)造成黃酮類化合物被氧化甚至結(jié)構(gòu)被破壞，因此不利于黃酮的提取，因此，在本試驗(yàn)中選擇30 min為宜。

如圖2-(e)可知所示，黃酮含量隨料液比的增大而呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)料液比為1∶40 時(shí)，黃酮含量為(8.29±0.40) mg/g，當(dāng)料液比持續(xù)增大時(shí)，黃酮溶出開始下降。這可能是由于在植物細(xì)胞內(nèi)，黃酮類化合物主要以苷鍵、酯鍵等疏水鍵與蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)結(jié)合，在浸提黃酮時(shí)，溶劑需先進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)破壞此類疏水鍵。當(dāng)料液比逐漸增大時(shí)，溶劑滲透并擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)的速度增快，更有利于破壞疏水鍵，因此黃酮化合物可向溶劑中擴(kuò)散，使得提取量增高。而溶劑用量過大會(huì)造成分相鹽用量增加，耗費(fèi)大量的溶劑和銨鹽。綜合考慮，超聲輔助雙水相提取小米黃酮的料液比選1∶40較為適宜。

綜上可知，小米黃酮提取量隨著丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高而升高，但丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高時(shí)會(huì)引起體系不穩(wěn)定，甚至造成(NH4)2SO4結(jié)晶析出；而提取時(shí)間過長時(shí)，會(huì)引起黃酮類化合物結(jié)構(gòu)被破壞。考慮到實(shí)際應(yīng)用時(shí)的成本問題及可行性，本試驗(yàn)選擇(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)、超聲提取溫度及料液比進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化。

2.3 正交優(yōu)化超聲輔助雙水相提取小米黃酮

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按L9(34)設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)因素及水平如表1所示，3因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表1 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)水平因素設(shè)計(jì)Table 1 The levels and factors of orthogonal experimentaldesign of L9 (34)

表2小米黃酮提取工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
Table2Theresultsandanalysisofoptimizationofmilletflavonoidsextractionwithorthogonalexperiment

序號(hào)ABC空列黃酮含量/(mg·g-1)11 (30)1 (15)1(1∶30)16.43212 (17)2 (1∶40)26.99313 (19)3 (1∶50)36.2542 (35)1236.79522315.39623126.7873 (40)1326.08832137.02933218.56k16.5576.4336.7436.793k26.3206.4677.4476.617k37.2207.1975.9076.687R0.9000.7641.5400.176

比較本試驗(yàn)中A、B、C三個(gè)因素的R值的大小可看出，影響小米黃酮提取的因素為C>A>B，即料液比>超聲溫度>(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)(表2)。對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析可知，A、B、C各因素存在水平效應(yīng)的差異且均達(dá)到顯著水平(表3)。因此，綜合分析可得，小米黃酮的最佳提取工藝為A3B3C2，即當(dāng)丙酮與(NH4)2SO4溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)在雙水相體系中分別為31%、19%時(shí)，在料液比1∶40的條件下，于40 ℃下超聲輔助提取30 min，小米黃酮提取量可達(dá)8.56 mg/g。

2.4 不同加工方法對(duì)小米黃酮提取量的影響

不同加工方法對(duì)小米黃酮含量的影響如圖3所示。不同加工方式對(duì)小米黃酮含量影響明顯，對(duì)小米原料進(jìn)行煮、燜、炒處理時(shí)，隨著處理時(shí)間的增長，其黃酮含量均隨之降低，且各處理水平下黃酮含量均低于未處理(8.56 mg/g)。煮制和燜制以水為傳熱介質(zhì)，其中煮需要的水量和火力明顯大于燜，相較于燜，小米在煮制過程中，更多水分可以進(jìn)入小米組織細(xì)胞中使之膨脹，在提取時(shí)可使黃酮成分有效溶出，因此，對(duì)比煮和燜，小米在經(jīng)過煮制處理后黃酮含量要明顯高于燜。此外，由于持續(xù)較高溫度作用，會(huì)造成部分黃酮分解，同時(shí)部分雜質(zhì)溶出或蛋白質(zhì)變性會(huì)阻礙黃酮的溶出[26]，所以隨著處理時(shí)間的延長，黃酮含量明顯下降。在炒制處理中，黃酮含量在處理1 min時(shí)最高，為(6.53±0.21) mg/g，隨著炒制時(shí)間的延長不斷下降，由于小米在炒制前先經(jīng)過蒸制處理，水分進(jìn)入小米組織細(xì)胞從而使細(xì)胞間隙變大，當(dāng)小米再經(jīng)過熱油翻炒，油溫從小米表面?zhèn)鬟f到小米內(nèi)部，黃酮類化合物在高溫的影響下迅速被破壞，其含量要明顯低于其他處理。而在蒸制處理中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)蒸制時(shí)間小于15 min時(shí)，黃酮含量要高于未處理，且在15 min時(shí)能達(dá)到(9.32±0.26) mg/g。在蒸制過程中，主要是以水蒸氣為傳熱介質(zhì)對(duì)流換熱[27]，水蒸汽進(jìn)入小米組織細(xì)胞中使之膨脹，導(dǎo)致細(xì)胞間隙變大甚至組織細(xì)胞膜壁破裂，提高了黃酮的溶出，所以在一定時(shí)間內(nèi)有助于黃酮的提取，而在長時(shí)間作用下，可能使其分解而降低提取量。綜上，在對(duì)小米進(jìn)行加工處理時(shí)，煮制或者短時(shí)間的蒸制最為理想，對(duì)黃酮含量損失相對(duì)較少。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 The results of variance analysis

圖3 不同加工方式對(duì)小米黃酮提取量的影響Fig.3 The effects of different processing methods on the extraction of millet flavonoids

2.5 小米黃酮提取物的抗氧化活性研究

將小米黃酮提取液分別用乙醇稀釋至0.08，0.16，0.32，0.48，0.64，0.80 mg/mL，分別檢測各底物濃度作用下DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力及鐵還原力，分析小米黃酮的抗氧化能力(見圖4)。

圖4 小米黃酮抗氧化活性測定 (DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、鐵還原力)Fig.4 Determination of antioxidant activities of millet flavonoids (DPPH clearance rate, hydroxyl radical clearance rate, reducing power)

由圖4可知，隨著底物質(zhì)量濃度增加(0.08～0.8 mg/mL)，各檢測指標(biāo)均隨之增加，并表現(xiàn)出一定的劑量依賴性。當(dāng)黃酮質(zhì)量濃度為0.64 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基清除率為(87.90±2.98)%；當(dāng)質(zhì)量濃度增至0.8 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率可達(dá)(94.80±3.10)%，且增勢逐漸趨于平緩，由此可知小米黃酮對(duì)DPPH自由基有明顯的清除作用。結(jié)晶紫法檢測羥自由基清除能力結(jié)果顯示：當(dāng)小米質(zhì)量濃度為0.08 mg/mL時(shí)，羥自由基清除率僅為(12.00±1.54)%，而當(dāng)質(zhì)量濃度增至0.8 mg/mL時(shí)，清除率可達(dá)(87.53±2.08)%，且隨著質(zhì)量濃度的增加，清除率增勢隨之減緩，因此，小米黃酮對(duì)羥自由基也具有明顯的清除作用。在還原鐵體系中，具有較強(qiáng)還原力的物質(zhì)能把Fe3+還原成Fe2+，因此可通過顯色反應(yīng)來判斷還原的程度，反應(yīng)后吸光度越大，表示還原能力越強(qiáng)[28]。隨著底物質(zhì)量濃度的增加，吸光值隨之增加，當(dāng)質(zhì)量濃度增至0.8 mg/mL時(shí)，吸光值達(dá)到(0.69±0.02)，說明小米黃酮能夠作為一種良好的電子供應(yīng)者。綜上，通過對(duì)不同質(zhì)量濃度小米黃酮作用下各抗氧化指標(biāo)的檢測，均表明其具有良好的抗氧化活性。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)主要采用了超聲輔助雙水相方法對(duì)小米黃酮進(jìn)行提取，通過正交法優(yōu)化提取工藝，結(jié)果顯示，當(dāng)丙酮與(NH4)2SO4溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)在雙水相體系中分別為31%、19%時(shí)，在料液比為1∶40(g∶mL)的條件下，于40 ℃下超聲輔助提取30 min，小米黃酮含量可達(dá)8.56 mg/g。同時(shí)，本文還研究了常見的加工方式對(duì)小米黃酮的影響，結(jié)果顯示煮制或短時(shí)間(<15 min)的蒸制最為理想，對(duì)黃酮含量損失相對(duì)較少，且隨著加工時(shí)間的延長，黃酮含量隨之降低。綜合而言，優(yōu)選的加工方式為煮>蒸>燜>炒。此外，本文還對(duì)小米黃酮抗氧化活性進(jìn)行了分析，隨著底物質(zhì)量濃度的增加，小米黃酮提取液的DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力及鐵還原力均增加，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，表明其具有良好的抗氧化活性。

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