余娛樂，賀稚非,2，李洪軍,2*

1(西南大學 食品科學學院，重慶 北碚，400716) 2(重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 北碚，400716)

動物蛋白具有較高的營養(yǎng)價值，可直接加工成食品或作為營養(yǎng)強化劑、氨基酸強化劑用作保健食品、運動食品等功能性食品配料。由于其具有良好的功能特性，還可作為食品添加劑，如穩(wěn)定劑、增稠劑、乳化劑等用于食品加工[1]。

目前，蛋白質(zhì)提取方法主要有酶解法、熱浸提法、pH調(diào)節(jié)法，有機溶劑萃取法[1-2]等。其中，由HULTIN[3]提出的pH調(diào)節(jié)法(pH-shifting)，即在酸/堿極端pH條件下使蛋白質(zhì)溶解再在等電點沉淀回收，因具有提取時間短、回收率高、蛋白變性程度小、安全性好等特點[4]，在植物蛋白、水產(chǎn)蛋白領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用和研究[5-6]。雖然變性程度小，但在提取過程中極端pH也會使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)會發(fā)生一系列變化，如溶解度、疏水性、凝膠性質(zhì)發(fā)生改變。

兔肉具有高蛋白、高消化率、高賴氨酸、低脂肪、低熱量、低膽固醇的營養(yǎng)特性[7]，屬于優(yōu)質(zhì)蛋白來源。但兔肉具有特殊腥味物質(zhì)并在加工過程中難以掩蓋和去除[8]，且骨頭較多，這對兔肉加工和食用均有影響，兔肉深加工亟待發(fā)展。在水產(chǎn)加工業(yè)，利用魚肉制備魚分離蛋白(魚糜)及魚糜制品，很好地解決了某些魚類因帶有土腥味和刺多不宜食用的問題，提高了這些魚類的經(jīng)濟價值[9]。作為優(yōu)質(zhì)蛋白來源，兔肉同樣可作為原料用于制備兔肉分離蛋白和兔糜制品，可豐富兔肉制品種類。

目前，pH調(diào)節(jié)法在兔肉加工業(yè)中還未見研究，pH調(diào)節(jié)誘導兔肉功能蛋白性質(zhì)變化的影響也沒有報道。為促進兔肉深加工，本實驗以兔肉為原料，在已有研究基礎(chǔ)上，研究pH調(diào)節(jié)法對兔肉功能性蛋白肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的影響，旨在為pH調(diào)節(jié)法提取兔肉蛋白工藝提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗兔購于重慶阿興記食品有限公司統(tǒng)景養(yǎng)兔場，品種為伊拉兔配套系，70日齡公兔20只。按常規(guī)方法擊暈放血宰殺，去皮去頭去爪后采肉。去除明顯脂肪和結(jié)締組織并混合絞碎，按60 g/袋分裝于自封袋中作好標記，-18 ℃貯藏備用。

牛血清蛋白和Tris堿為生化試劑，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UB-7 pH計，德國Sartorius AG公司；電子分析天平，賽多利斯科學儀器有限公司；722型可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；Avanti J-301冷凍離心機，美國貝克曼庫爾特公司；XHF-D 型勻漿機寧波新芝生物科技股份有限公司；CT-3質(zhì)構(gòu)分析儀，美國Brookfield公司；UltraScan PRO測色儀，美國HunterLab公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 肌原纖維蛋白的提取及含量測定

肌原纖維蛋白的提取參照XIONG[10]方法并作適當修改。絞碎后的兔肉提前于4℃冰箱解凍，加入4倍體積預(yù)冷的提取液A(0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液，0.1 mol/L NaCl，0.001 mol/L EDTA-2Na，0.002 mol/L MgCl2，pH 7.0)后7 000 r/min條件下均質(zhì)30 s，每均質(zhì)10 s后暫停10 s防止過熱。均質(zhì)液在8 500 r/min、4 ℃離心15 min，重復上述操作3次。在沉淀中加入4倍體積預(yù)冷的提取液B(0.1 mol/L NaCl，0.001 mol/L NaN3，pH 6.25)，7 000 r/min條件下均質(zhì)30s，均質(zhì)液在8 000 r/min、4℃離心15 min，重復上述操作3次，最后一次離心前用雙層紗布過濾。得到的沉淀即為肌原纖維蛋白。

蛋白濃度測定參照BENJAKUL[11]方法。稱取0.2 g 肌原纖維蛋白溶于20 ml預(yù)冷的提取液A中，3 000 r/min均質(zhì)30 s分散，用雙縮脲法測定蛋白含量(標準曲線y=0.042 3x-0.003 6,R2=0.999 6)，每個樣品重復測定3次。

1.3.2 肌原纖維蛋白的處理

參考付湘晉[12]方法并稍作修改。提取的肌原纖維蛋白轉(zhuǎn)入磁力攪拌器冰浴緩慢攪拌，分別調(diào)pH值為3.0、12.0，然后再調(diào)pH值到5.5，并10 000 r/min、4 ℃離心15 min。沉淀用少量冰水分散并調(diào)pH值至7.0，再次離心后所得沉淀即為酸堿處理后的肌原纖維蛋白，分別標記為ACM、AKM，未處理的蛋白記作NM。蛋白濃度測定同1.3.1。

1.3.3 溶解性的測定

參考AGYARE[13]和尚永彪[14]方法并稍作修改。肌原纖維蛋白用相應(yīng)濃度的NaCl溶液制成蛋白濃度2.5 mg/mL的溶液。4℃放置1 h后，8 000 r/min、4 ℃離心15 min，取上清液測定蛋白濃度，磷酸鹽緩沖液為空白。溶解度計算公式如下：

(1)

1.3.4 乳化活性和乳化穩(wěn)定性的測定

參考AGYARE[15]方法。肌原纖維蛋白用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)制成蛋白質(zhì)量濃度1 mg/mL的溶液。20.0 mL蛋白溶液和5.0 mL大豆油加入50mL塑料離心管中。10 000 r/min高速均質(zhì)60 s后立即從管底5 mm處吸取50 μL均質(zhì)液，加入5 mL、質(zhì)量分數(shù)為0.1% SDS溶液中，振蕩混勻并靜置10 min后測定波長500 nm處的吸光值，記作A0，0.1% SDS溶液做空白。10 min后在離心管相同位置再次吸取50 μL均質(zhì)液，按上述方法測定吸光值，記作A10。每個樣品重復測定3次。肌原纖維蛋白乳化活性(EAI)和乳化穩(wěn)定性(ESI)計算公式如下：

(2)

(3)

式中：A500表示波長500 nm處的吸光值；Ψ表示油相的體積分數(shù)；ρ表示蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，g/mL；A0、A10分別表示均質(zhì)液在0 min和10 min時的吸光值。

1.3.5 表面疏水性的測定

參考CHELH[16]方法。肌原纖維蛋白用0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)制成蛋白質(zhì)量濃度5 mg/mL的溶液。取1 mL蛋白液和200 μL 1 mg/mL溴酚藍于離心管中，1 mL磷酸鹽緩沖液和200 μL溴酚藍做空白對照，室溫振蕩10 min，8 000 r/min、4℃離心10 min，取上清液400 mL并稀釋10倍，測定波長595 nm處吸光值，磷酸鹽緩沖液為空白。表面疏水性計算公式如下：

(4)

1.3.6 總巰基和活性巰基的測定

參考任麗娜[17]方法。肌原纖維蛋白用0.6 mol/L KCl溶液制成蛋白質(zhì)量濃度4 mg/mL的溶液。取1 mL加入4 mL 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(0.6 mol/L KCl，0.001 mol/L EDTA-2Na，8 mol/L尿素，pH 7.0)。取4 mL上述混合液，加入0.4 mL 0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液(質(zhì)量分數(shù)為0.1% DTNB，pH 8.0)，振蕩混勻后于40 ℃水浴孵化25 min，測定波長412 nm處吸光值，以KCl溶液為空白。測得的巰基含量以mol/105g蛋白質(zhì)計，總巰基計算公式如下：

巰基含量/(μmol·g-1)=73.53×A412×D/C

(5)

活性巰基的測定用不含尿素的磷酸鹽緩沖液進行反應(yīng)，其他步驟和計算公式均相同。

式中：A412表示波長412 nm處的吸光值；D表示稀釋倍數(shù)；C表示樣品質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.3.7 凝膠性質(zhì)的測定

1.3.7.1 凝膠強度測定

采用CT-3質(zhì)構(gòu)儀進行凝膠強度測定。參數(shù)設(shè)置：測量長度10 mm，圓柱直徑25 mm，形變量30%，測試速度1.00 mm/s，始發(fā)點負載4 g，探頭TA 5。

1.3.7.2 凝膠白度測定

用色差儀測定肌原纖維蛋白凝膠的L*、a*、b*值后計算白度，白度計算公式如下：

(6)

1.3.7.3 凝膠保水性測定

參考SALVADOR[18]方法并稍作修改。取一定量蛋白凝膠置于5 mL離心管中，8 000 r/min、4 ℃離心15 min，測定離心前后凝膠的質(zhì)量，計算凝膠保水性。保水性計算公式如下：

(7)

式中：m1為離心后蛋白凝膠的質(zhì)量；m2為離心前蛋白凝膠的質(zhì)量。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016進行數(shù)據(jù)處理，SPSS 19.0進行方差顯著性分析，Origin 8.1繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH調(diào)節(jié)法對兔肉肌原纖維蛋白溶解性的影響

由圖1可知，3種肌原纖維蛋白溶解性均隨著NaCl含量的增加而增加。在NaCl質(zhì)量分數(shù)低于1%時，3種肌原纖維蛋白的溶解性沒有顯著差異(p<0.01)。當NaCl質(zhì)量分數(shù)增加到2%時，AKM溶解性極顯著低于NM(p<0.01)，而ACM溶解性較NM下降不顯著(p<0.01)，且ACM和AKM間無顯著差異(p<0.05、p<0.01)。當NaCl質(zhì)量分數(shù)增加到3%時，處理后的肌原纖維蛋白溶解性極顯著低于原肌原纖維蛋白(p<0.01)。

圖1 pH調(diào)節(jié)法對兔肉肌原纖維蛋白溶解性的影響Fig.1 The effect of pH-shifting on the solubility of myofibril protein

蛋白質(zhì)溶解性是蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-溶劑之間相互作用平衡的熱力學表現(xiàn)形式[19]，溶解性變化說明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定變化。極端酸堿條件可能會導致蛋白質(zhì)分子發(fā)生展開或者解離并引起構(gòu)象變化[20]，所以溶解性改變。由實驗結(jié)果可知，AKM溶解性最低，所以堿法處理后蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)更明顯。可能因為兔肉肌原纖維蛋白在pH 3.0條件比堿性條件穩(wěn)定性更好，變性程度較低。

2.2 pH調(diào)節(jié)法對兔肉肌原纖維蛋白乳化性的影響

由圖2可知，酸堿處理后的肌原纖維蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性均發(fā)生一定程度下降。其中，酸法處理后蛋白乳化活性雖下降，但和原肌原纖維蛋白相比沒有顯著差異(p<0.01)，堿法處理后乳化活性較原肌原纖維蛋白發(fā)生了極顯著降低(p<0.01)。此外，酸堿處理后肌原纖維蛋白的乳化穩(wěn)定性均低于原肌原纖維蛋白(p<0.01)，且酸/堿2種方法之間沒有顯著差異(p<0.01)。

圖2 pH調(diào)節(jié)法對兔肉肌原纖維蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響Fig.2 The effect of pH-shifting on EAI and ESI of myofibril protein

乳化活性是表示蛋白質(zhì)作為乳化劑的乳化能力強弱的指標，乳化活性越大，單位質(zhì)量蛋白質(zhì)乳化的油量越多[21]。一般蛋白質(zhì)的乳化性和溶解性密切相關(guān)，溶解性越大，蛋白質(zhì)可以更迅速擴散至水油潔面然后形成界面膜參與乳化作用[22]，乳化性越好。pH調(diào)節(jié)處理誘導肌原纖維蛋白溶解性下降從而導致乳化活性下降，而AKM的乳化活性最低，這和溶解性變化的研究結(jié)果一致。

2.3 pH調(diào)節(jié)法對兔肉肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

由圖3可知，pH調(diào)節(jié)處理后的兔肉肌原纖維蛋白表面疏水性極顯著增加(p<0.01)，和一些魚肉蛋白的研究結(jié)果相似[9, 12]。酸/堿2種方法相對比，堿法處理后的蛋白表面疏水性最大為93.04%，堿法對蛋白性質(zhì)影響大于酸法。

表面疏水性可表征蛋白質(zhì)分子表面疏水殘基的相對含量。天然蛋白質(zhì)分子中，親水基團一般在外部并和水分子相互作用，疏水基團則在分子內(nèi)部聚集[9]。酸堿處理后肌原纖維蛋白分子構(gòu)象發(fā)生變化，結(jié)構(gòu)展開，疏水基團暴露在外，所以表面疏水性增大。表面疏水性增加也會影響蛋白質(zhì)的溶解性，一般表面疏水性越大蛋白質(zhì)的溶解性越小。堿法處理后AKM表面疏水性大于ACM和NM，說明堿法處理后蛋白質(zhì)分子展開程度更大，內(nèi)部疏水基團暴露更嚴重。此外，表面疏水性也會影響蛋白質(zhì)乳化性[23]。

圖3 pH調(diào)節(jié)法對兔肉肌原纖維蛋白表面疏水性的影響Fig.3 The effect of pH-shifting on surface hydrophobicity of myofibril protein

2.4 pH調(diào)節(jié)法對兔肉肌原纖維蛋白濁度的影響

由圖4可知，3種肌原纖維蛋白的濁度大小為AKM>ACM>NM，pH調(diào)節(jié)法處理后蛋白濁度極顯著升高(p<0.01)，其中AKM最大，極顯著大于ACM和NM(p<0.01)。

圖4 pH調(diào)節(jié)法對兔肉肌原纖維蛋白濁度的影響Fig.4 The effect of pH-shifting on turbidity of myofibril protein

濁度是反應(yīng)蛋白質(zhì)溶液中粒子大小和數(shù)量的指標，可以表征蛋白質(zhì)分子聚集程度[24]。處理后蛋白溶液濁度升高，說明蛋白質(zhì)分子嚴重聚集，特別是堿處理。當?shù)鞍踪|(zhì)內(nèi)部疏水基團暴露在外后，蛋白質(zhì)分子間可以通過疏水相互作用力相互聚集，堿處理后蛋白質(zhì)分子濁度最大，這也一定程度表明堿處理后蛋白質(zhì)分子展開更嚴重，相比酸處理暴露更多疏水基團，這一結(jié)果也和表面疏水性的測定結(jié)果一致。

2.5 pH調(diào)節(jié)法對兔肉肌原纖維蛋白巰基含量的影響

由圖5可知，2種方法處理后，兔肉肌原纖維蛋白的總巰基含量發(fā)生下降，且NM>ACM>AKM，其中AKM總巰基含量極顯著低于NM和ACM(p<0.01)，分析原因可能因為蛋白質(zhì)-SH在堿性條件下更易發(fā)生氧化，而在酸性條件下被抑制[12]。ACM和AKM的活性巰基含量雖發(fā)生一定程度下降，但相比NM變化并不顯著(p<0.01)。

巰基是肌原纖維蛋白中重要的功能基團，巰基含量對蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和理化性質(zhì)均有重要意義。一些加工處理方式會導致蛋白質(zhì)分子的-SH生成-S-S-，總巰基含量減少從而導致蛋白質(zhì)性質(zhì)變化[12, 17]。堿性條件下巰基更易被氧化，所以AKM的總巰基含量最低。而活性巰基含量變化不顯著可能因為pH調(diào)節(jié)過程中蛋白質(zhì)分子發(fā)生展開，內(nèi)部隱藏巰基轉(zhuǎn)變?yōu)楸砻婊钚詭€基[17]，所以活性巰基含量變化不顯著(p<0.01)。該結(jié)果也表明pH調(diào)節(jié)法會誘導兔肉功能性蛋白肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，堿法處理后變性程度比酸法更大。

圖5 pH調(diào)節(jié)法對兔肉肌原纖維蛋白巰基含量的影響Fig.5 The effect of pH-shifting on total sulfhydryl and active sulfhydryl content of myofibril protein

2.6 pH調(diào)節(jié)法對兔肉肌原纖維蛋白凝膠性質(zhì)的影響

由圖6可知，2種處理后的肌原纖維蛋白凝膠品質(zhì)均發(fā)生一定劣化。NM的凝膠強度分別為NM>ACM>AKM。其中，AKM的凝膠強度極顯著低于NM(p<0.01)，而ACM凝膠強度在p<0.01水平時差異不顯著。ACM和AKM的凝膠持水性較NM發(fā)生極顯著降低(p<0.01)，其中，AKM的持水性最低，極顯著低于ACM(p<0.01)。凝膠白度變化不顯著(p<0.01、p<0.05)。

肌原纖維蛋白熱誘導凝膠的形成主要是氨基酸側(cè)鏈結(jié)合鍵斷裂、分子伸展或折疊、內(nèi)部基團暴露，然后相互聚集、交聯(lián)形成蛋白質(zhì)三級網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[25]。極端pH條件下肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)發(fā)生不同程度變化，從而導致凝膠特性發(fā)生劣變。其中堿法pH 12.0極端堿性條件下劣變最嚴重，所以凝膠特性最差。酸法處理過程中，pH 3.0條件下雖然肌原纖維蛋白同樣發(fā)生了變性，但其變性程度比pH 12.0小。

圖6 pH調(diào)節(jié)法對兔肉肌原纖維蛋白凝膠品質(zhì)的影響Fig.6 The effect of pH-shifting on gel properties of myofibril protein

3 結(jié)論

由實驗可知，pH調(diào)節(jié)法會誘導兔肉肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)發(fā)生變化。pH 3.0～5.5、pH 12.0～5.5兩種條件均導致兔肉肌原纖維蛋白溶解性顯著下降(p<0.01)，相應(yīng)的肌原纖維蛋白乳化性活性也呈現(xiàn)下降趨勢，其中AKM乳化活性最低，ACM較NM變化不顯著(p<0.01)。兩種處理方式下肌原纖維蛋白的表面疏水性極顯著增大(p<0.01)，從4.17%分別增大到43.17%(酸法)和93.04%(堿法)。此外，pH調(diào)節(jié)使蛋白質(zhì)總巰基含量降低，ACM和AKM總巰基含量極顯著低于NM(p<0.01)，其中AKM總巰基含量最低，極顯著低于ACM(p<0.01)。活性巰基含量雖發(fā)生下降，但變化不顯著(p<0.01)。對肌原纖維蛋白熱致凝膠品質(zhì)進行研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)變化導致ACM和AKM蛋白凝膠強度、持水性均低于NM，白度變化不明顯，ACM凝膠品質(zhì)整體優(yōu)于AKM，說明堿法變性程度更大。

pH調(diào)節(jié)法制備兔肉分離蛋白會導致兔肉肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)發(fā)生一定改變，其中酸法處理后蛋白變性程度更小，所以酸法(pH 3.0～5.5)處理更適合兔肉分離蛋白的提取。

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