朱昊，薛正蓮,2*，王洲,2，陳阿娜,2，楊蒙

1(安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖，241000)2(微生物發(fā)酵安徽省工程研究中心，安徽 蕪湖，241000)

磷脂酶A1是一類專一水解磷脂sn-1位?；a(chǎn)生溶血磷脂和自由脂肪酸的酶類，廣泛存在于各種動(dòng)植物和微生物體中[1]。磷脂酶A1生物功能可歸納為3類：細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的維護(hù)和修復(fù)；細(xì)胞內(nèi)代謝機(jī)制和信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)及體內(nèi)磷脂的消化[2]。 溶血磷脂可被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、飼料改良和醫(yī)藥等領(lǐng)域[3]。

蘇燕南等[4]在研究粘質(zhì)沙雷氏菌生產(chǎn)磷脂酶A1的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)：在磷脂酶A1編碼基因plaA的下游存在一段輔助蛋白編碼序列plaS基因，它與磷脂酶A1在大腸桿菌中的高活性表達(dá)密切相關(guān)，同時(shí)顯示對(duì)宿主細(xì)胞有抑制作用。進(jìn)一步的研究表明，此輔助蛋白PlaS屬于錨蛋白ANK家族[5]。ANK家族錨蛋白是一類廣泛存在于自然界的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞生理功能的實(shí)現(xiàn)和調(diào)控方面具有重要意義[6]。如在銅綠假單胞菌中存在一段類似于磷脂酶輔助蛋白的基因(ANKB)，這段基因和過(guò)氧化酶基因?qū)儆谕粋€(gè)操縱子中，且位于下游無(wú)重疊基因，屬于ANK家族，ANKB蛋白位于細(xì)胞周質(zhì)空間，具有信號(hào)肽，對(duì)于過(guò)氧化氫酶的表達(dá)具有重要的調(diào)控作用[7]。ALCOFORADO等[8]的研究也發(fā)現(xiàn)在粘質(zhì)沙雷氏菌中六型分泌表達(dá)系統(tǒng)和輔助蛋白對(duì)其種間競(jìng)爭(zhēng)有一定的調(diào)節(jié)作用。

為進(jìn)一步揭示粘質(zhì)沙雷氏菌中磷脂酶A1輔助蛋白PlaS對(duì)磷脂酶A1合成及對(duì)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)行為調(diào)控的機(jī)制，深入研究磷脂酶A1輔助蛋白PlaS具有重要的理論和實(shí)踐指導(dǎo)意義。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)磷脂酶A1輔助蛋白PlaS的相關(guān)研究報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)室張爽等[9]在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)輔助蛋白plaS基因在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中構(gòu)建成功后很難表達(dá)，僅在Western Blot技術(shù)下才見(jiàn)有少量表達(dá)，而且對(duì)宿主菌的生長(zhǎng)也有一定的抑制作用。國(guó)內(nèi)外均有研究者通過(guò)截短氮端促進(jìn)蛋白表達(dá)[10-13]。

本實(shí)驗(yàn)去除了plaS基因的前35個(gè)氨基酸，使其與pET-28a(+)載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，實(shí)現(xiàn)了目的蛋白的異源表達(dá)。通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，使目的蛋白達(dá)到最大表達(dá)量，為輔助蛋白胞外可溶性表達(dá)奠定了基礎(chǔ)，也為輔助蛋白的純化及后續(xù)功能的深入研究提供了參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒與儀器

粘質(zhì)沙雷氏菌PL-06，BL21(DE3)，質(zhì)粒載體pET-28a(+)為本實(shí)驗(yàn)室保存，P28為本實(shí)驗(yàn)室在前期實(shí)驗(yàn)中將pET-28a(+)載體質(zhì)粒導(dǎo)入BL21(DE3)表達(dá)宿主中構(gòu)建的空載，SP28為本實(shí)驗(yàn)室在前期實(shí)驗(yàn)中以pET-28a(+)為載體，插入plaS基因片段，導(dǎo)入BL21(DE3)表達(dá)宿主中構(gòu)建并保存的菌株。

本文使用寧波新芝牌超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

LB培養(yǎng)基(1 L)：酵母膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 10 g、H2O 1 000 mL、pH 7.0。

卡那霉素(Kan)溶液：向8 mL滅菌去離子水中加入0.5 g卡那霉素，溶解后定容至10 mL。經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，分裝置于在-20 ℃保存。

100 mmol/L IPTG溶液：向40 mL滅菌去離子水中加入1.19 g 的IPTG，溶解后定容至50 mL。經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，分裝置于在-20 ℃保存。

LB+Kan固體培養(yǎng)基：待融化的LB固體培養(yǎng)基冷卻到一定溫度時(shí), 加入卡那霉素，使其終質(zhì)量濃度為50 μg/mL。

1%瓊脂糖凝膠：向20 mL 1×TAE緩沖液中加入0.2 g瓊脂糖粉，加熱使完全溶解，待冷卻至50～60 ℃時(shí)加入1 μL EB，混勻后倒入制膠模具中插上梳子，室溫冷卻凝固即可。

限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ 購(gòu)自賽默飛世爾科技公司。Taq酶購(gòu)于BBI生物公司，其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 輔助蛋白N端截短菌株的設(shè)計(jì)和構(gòu)建

通過(guò)對(duì)輔助蛋白的氨基酸序列預(yù)測(cè)與比對(duì)，發(fā)現(xiàn)PlaS輔助蛋白序列與錨定蛋白重組子家族(ANK家族)存在一定同源性，氨基酸序列在種間保守性較高，相似度達(dá)80%。對(duì)之前在NCBI上釋放的輔助蛋白PlaS序列進(jìn)行信號(hào)肽分析，發(fā)現(xiàn)前35AA為信號(hào)肽區(qū)域(圖1)。

圖1 信號(hào)肽分析Fig.1 Signal peptide analysis

為使蛋白成功表達(dá)，綜合考慮后決定通過(guò)PCR方法去除前35AA。根據(jù)已知的plaS基因序列，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)截?cái)郚端的引物，引物序列見(jiàn)表1。

表1 dSP28引物序列Table 1 dSP28 Primers

注：劃線部分分別為BamHⅠ、HindⅢ酶切位點(diǎn)。

以本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的SP28質(zhì)粒為模板， P1，P2為引物，用Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增dplaS基因，擴(kuò)增條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 35 s；56 ℃ 35 s；72 ℃ 45 s；72 ℃ 8 min。對(duì)擴(kuò)增后的基因片段進(jìn)行膠回收，雙酶切后與pET-28a(+)載體鏈接，并轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。隨后挑取陽(yáng)性克隆子進(jìn)行PCR驗(yàn)證，并送上海生工生物有限公司測(cè)序，將測(cè)序正確的菌種進(jìn)行保種，即得到1株構(gòu)建成功的dSP28表達(dá)菌株。

1.4 dSP28誘導(dǎo)表達(dá)及條件優(yōu)化

以P28空載為對(duì)照，從LB+Kan的平板上分別挑取P28和dSP28單菌落至100 mL LB+Kan的液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，按2%的接種量接種至100mL LB+Kan的培養(yǎng)液中，至OD600nm值為0.7時(shí)加入0.2 mmol/L IPTG對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)4 h后取菌液制備蛋白樣品，并進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，確定目的蛋白表達(dá)部位。根據(jù)已確定的蛋白表達(dá)部位，分別對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間、IPTG濃度、初始OD600nm值和溫度進(jìn)行優(yōu)化，提高蛋白表達(dá)量。其中誘導(dǎo)時(shí)間分別為：2、4、6、8、10 h；IPTG誘導(dǎo)濃度分別為: 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L；初始OD600nm值分別為: 0.1，0.2，0.4，0.7，0.9；溫度分別為: 28、31、34、37、40、43、46 ℃。

1.5 P28、SP28與dSP28在最優(yōu)表達(dá)條件下OD600nm值的測(cè)定

從LB+Kan的平板上分別挑取P28、SP28和dSP28單菌落至100 mL LB+K的液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，按2%的接種量接種至100 mL LB+Kan的培養(yǎng)液中，按最佳誘導(dǎo)條件進(jìn)行培養(yǎng)，每2 h取樣測(cè)1次OD600nm值，并繪制發(fā)酵曲線。

1.6 SDS-PAGE蛋白電泳樣品制備

1.6.1 發(fā)酵液上清蛋白的制備

(1)取20 mL菌液，用離心機(jī)于12 000 r/min離心10 min，取18 mL上清液至干凈的離心管中；

(2)在4 ℃下，緩慢加入95%的乙醇18 mL；

(3)將二者充分振蕩，于-20 ℃放置10 min；

(4)4 ℃，12 000 r/min，離心15 min，去上清，晾干；

(5)加入400 μL TE緩沖液重懸沉淀；

(6)從重懸沉淀中取80 μL，加入20 μL 5×Loading buffer混合后，100 ℃煮5 min；

(7)于12 000 r/min離心1 min，取上清蛋白20 μL進(jìn)行蛋白電泳。

1.6.2 全菌樣品的制備

取500 μL菌液，用離心機(jī)于9 000 r/min離心2 min，棄上清，加入80 μL TE，吹懸后加入20 μL 5×Loading buffer，100 ℃煮5 min，12 000 r/min，離心1 min，取上清蛋白20 μL進(jìn)行蛋白電泳。

1.6.3 破碎上清蛋白的制備

(1)取20 mL發(fā)酵液，用離心機(jī)于4 000 r/min離心5 min，收集菌體沉淀；

(2)取20 mL PB緩沖液重懸菌體，于4 000 r/min離心5 min，收集菌體沉淀，重復(fù)此步驟1次；

(3)將收集到的沉淀用20 mL PB緩沖液重懸，冰浴10 min，用細(xì)胞破碎儀300 W，3 s工作，3 s停頓，超聲破碎10 min；

(4)將破碎后的菌液于12 000 r/min離心10 min，取18 mL上清液至干凈的離心管中；

(5)在4 ℃下，緩慢加入95%的乙醇18 mL；

(6)將二者充分振蕩數(shù)分鐘，于-20 ℃放置10 min；

(7)4 ℃，12 000 r/min，離心15 min，去上清，晾干；

(8)加入400 μL TE緩沖液重懸沉淀；

(9)從重懸沉淀中取80 μL，加入20 μL 5×Loading buffer混合后，100 ℃煮5 min；

(10)于12 000 r/min離心1 min，取上清蛋白20 μL進(jìn)行蛋白電泳。

1.6.4 破碎菌體蛋白的制備

(1)用20 mL PB緩沖液重懸超聲破碎后離心得到的沉淀；

(2)從(1)中取500 μL重懸液，用離心機(jī)9 000 r/min，離心2 min，棄上清，加入80 μL TE，吹懸后加入20 μL 5×Loading buffer 100 ℃煮5 min，12 000 r/min，離心1 min，取上清蛋白20 μL進(jìn)行蛋白電泳。

2 結(jié)果與分析

2.1 dSP28菌株的構(gòu)建和驗(yàn)證

以引物P1和P2擴(kuò)增得到的片段大小為651 bp(圖2)，將擴(kuò)增好的片段與載體相連，轉(zhuǎn)化。隨后，從帶有Kan抗性的平板上挑取轉(zhuǎn)化子，接種至5 mL LB+Kan液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，次日，從該菌液中提取質(zhì)粒作為模板，以P1，P2為引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，根據(jù)瓊脂糖電泳圖中條帶大小判斷陽(yáng)性克隆子(圖3)，并將PCR驗(yàn)證正確的菌株送上海生工生物有限公司測(cè)序，用DNAMAN對(duì)序列進(jìn)行分析比對(duì)，序列一致則對(duì)該菌株保種，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

M-Marker圖2 SP28中dplaS的PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification gene dplaS and in SP28

M-marker； 1-菌落PCR結(jié)果圖3 dSP28菌落PCR驗(yàn)證Fig.3 The colony PCR of dSP28

2.2 dSP28目的蛋白表達(dá)位置判斷

M-marker；1、3、5、7分別是P28的全菌、發(fā)酵液上清蛋白、破碎上清蛋白、破碎菌體蛋白；2、4、6、8分別是dSP28的全菌、發(fā)酵液上清蛋白、破碎上清蛋白、破碎菌體蛋白圖4 P28和dSP28SDS-PAGEFig.4 The SDS-PAGE of P28 and dSP28

按1.4的方法，分別對(duì)P28和dSP28進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，制備蛋白樣品。SDS-PAGE蛋白電泳結(jié)果(圖4)表明，dSP28中目的蛋白在全菌和破碎菌體中均有較高的表達(dá)量，后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)可通過(guò)全菌中目的蛋白在電泳圖中相應(yīng)分子量處條帶粗細(xì)變化來(lái)確定優(yōu)化條件。

2.3 dSP28表達(dá)條件的優(yōu)化

2.3.1 誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化

以2%的接種量將dSP28種子液接種至100mL LB+Kan的液體培養(yǎng)基中，至OD600nm值為0.7時(shí)加入0.2 mmol/L IPTG，于37 ℃，200 r/min對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)，在誘導(dǎo)后2、4、6、8、10 h分別取樣制備蛋白電泳。結(jié)果(圖5)可知，最佳誘導(dǎo)時(shí)間為加入IPTG后8 h。

M-marker；1、3、5、7-P28的誘導(dǎo)時(shí)間分別為：2、4、6、8 h；2、4、6、8、9dSP28的誘導(dǎo)時(shí)間分別為：2、4、6、8、10 h圖5 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)dSP28表達(dá)的影響Fig.5 Effect of induction time on dSP28 protein expression

2.3.2 IPTG濃度的優(yōu)化

以2%的接種量將dSP28種子液接種至100 mL LB+Kan的液體培養(yǎng)基中，至OD600nm值為0.7時(shí)，分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的IPTG，37 ℃，200 r/min誘導(dǎo)8 h，制備蛋白樣品，進(jìn)行電泳。通過(guò)SDS-PAGE蛋白電泳圖發(fā)現(xiàn)(圖6)，最佳IPTG濃度為0.2 mmol/L。

M-marker；1～6-IPTG 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L圖6 IPTG濃度對(duì)dSP28表達(dá)的影響Fig.6 Effect of IPTG concentration on dSP28 protein expression

2.3.3 初始OD600nm值的優(yōu)化

以2%的接種量將dSP28種子液接種至100 mL LB+Kan的液體培養(yǎng)基中，在初始OD600nm值分別為: 0.1、0.2、0.4、0.7、0.9時(shí)，加入0.2 mmol/L IPTG，37 °C，200 r/min誘導(dǎo)8 h，制備蛋白樣品。SDS-PAGE蛋白圖電泳表明(圖7)，最佳初始OD600nm值為0.7。

M-marker；1～5-OD600nm值分別為：0.1、0.2、0.4、0.7、0.9圖7 初始OD600nm值對(duì)dSP28表達(dá)的影響Fig.7 Effect of induction starting OD600nm on dSP28 protein expression

2.3.4 誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化

以2%的接種量將dSP28種子液接種至100 mL LB+Kan的液體培養(yǎng)基中，在初始OD600nm值為0.7時(shí)，加入0.2 mmol/L IPTG，將誘導(dǎo)溫度梯度設(shè)置為：28、31、34、37、40、43、46 ℃，誘導(dǎo)8 h，制備蛋白樣品。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖8)，最佳誘導(dǎo)溫度為40 ℃。

M：marker；1～7-28、31、34、37、40、43、46 ℃圖8 溫度對(duì)dSP28表達(dá)的影響Fig.8 Effect of induction temperature on dSP28 protein expression

2.4 P28、SP28和dSP28發(fā)酵中OD600nm值的測(cè)定

經(jīng)過(guò)表達(dá)條件的優(yōu)化，得到dSP28中dPlaS蛋白的最佳表達(dá)條件：誘導(dǎo)時(shí)間為8 h，IPTG濃度為0.2 mmol/L，起始菌濃(OD600nm值)為0.7，溫度為40 ℃，轉(zhuǎn)速為200 r/min。以此表達(dá)條件對(duì)P28、dSP28和SP28誘導(dǎo)前后OD600nm值進(jìn)行測(cè)定(圖9)，發(fā)現(xiàn)在按2%接種量接種后, 37 ℃，200 r/min，每0.5 h測(cè)1次OD600nm值時(shí)，3者菌濃差異并不明顯。而加入IPTG開(kāi)始誘導(dǎo)后，40 ℃，200 r/min，每2 h測(cè)1次OD600nm值時(shí)，SP28的菌濃先增長(zhǎng)后降低，并趨于平穩(wěn)，同時(shí)顯示輔助蛋白PlaS對(duì)宿主細(xì)胞有較強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制作用。P28和dSP28則一直處于增長(zhǎng)趨勢(shì)，且增幅較大，直到終止誘導(dǎo)，其依舊處于上升狀態(tài)。這一現(xiàn)象說(shuō)明輔助蛋白N端截短對(duì)PlaS蛋白表達(dá)有一定的促進(jìn)作用，且生長(zhǎng)較快，對(duì)宿主菌的抑制作用大大減弱，為后面實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

圖9 P28、SP28和dSP28發(fā)酵中OD600nm值測(cè)定Fig.9 Determination of OD600nm in P28, SP28 and dSP28 fermentation

3 討論

張爽等[9]在前期實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，磷脂酶A1輔助蛋白dPlaS在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中構(gòu)建成功后表達(dá)較為困難，只在Western Blot技術(shù)下有極少量的目的蛋白表達(dá)條帶，且對(duì)構(gòu)建的工程菌生長(zhǎng)有一定的抑制作用，這可能與其信號(hào)肽有關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中對(duì)plaS基因N端截短，去除了信號(hào)肽后發(fā)現(xiàn)，輔助蛋白可以在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行大量表達(dá)，進(jìn)行表達(dá)條件優(yōu)化后，在誘導(dǎo)時(shí)間為8 h，IPTG濃度為0.2 mmol/L，起始菌濃(OD600nm)為0.7，溫度為40 ℃，轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)在全菌中達(dá)到了最大表達(dá)量，而通過(guò)發(fā)酵中OD600nm值測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其在最優(yōu)表達(dá)條件下對(duì)宿主菌生長(zhǎng)抑制作用明顯減弱。這為后期蛋白大量胞外表達(dá)和純化奠定了基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步研究輔助蛋白對(duì)磷脂酶A1酶活的影響，及對(duì)輔助蛋白功能特性的深入研究提供了可能。

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