任梅娟，盧永昌，辛青霞，李 欣

(1.青海民族大學(xué) 藥學(xué)院，青海 西寧 810007；2.青海省青藏高原植物資源化學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810007；3.青海省藥物分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810007)

沙棘( Hippophae rhamnoides L.) 為多年生落葉灌木或小喬木，是一種喜光、耐水、耐旱、生長(zhǎng)性極好的小漿果植物，多為橘黃色或橘紅色[1].我國(guó)主要分布在西北、華北、東北及西南等十多個(gè)省區(qū)，全國(guó)約有100 萬(wàn) hm2[2].現(xiàn)代科學(xué)研究表明，沙棘果與沙棘籽富含蛋白質(zhì)、氨基酸、有機(jī)酸、多種維生素以及微量元素等對(duì)人體有益的功能活性成分和營(yíng)養(yǎng)成分，具有獨(dú)特的保健功能和藥用價(jià)值，享有“綠色黃金”的美譽(yù)[3].沙棘中的黃酮含量較高，主要是異鼠李素、槲皮素、山奈酚、楊梅素等黃酮苷元及其苷類.據(jù)報(bào)道，國(guó)外已分離出的沙棘黃酮類化合物有32種[4]，是因?yàn)檫@些豐富的黃酮類化合物，沙棘才具有了如治療心腦血管疾病(心肌缺血、心肌再灌注損傷、血栓)、抗癌、抗氧化、抗衰老、降血脂、降血糖、心臟保護(hù)等藥理作用[5].目前，工業(yè)上采用超臨界萃取沙棘油后，剩余的沙棘籽粕多為廢棄物.企業(yè)每年有大量沙棘籽粕無(wú)法處理，為探索沙棘籽粕的再利用，本試驗(yàn)采用高效液相色譜法，測(cè)定了沙棘籽粕中槲皮素、山柰酚、異李鼠素三種黃酮甙元，獲得了滿意結(jié)果，可為沙棘籽粕的二次開發(fā)提供依據(jù).

1 材料

1.1 儀器

Agilent1100高效液相色譜儀(配二極管陣列檢測(cè)器)；十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；SZ—97自動(dòng)三重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)；FW7362M/24電子分析天平(德國(guó)制造)；KQ-3200超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司).

1.2 藥品與試劑

沙棘籽粕購(gòu)自青?？灯盏律镏破酚邢薰?

甲醇為色譜純，購(gòu)自山東禹王實(shí)業(yè)有限公司禹城化工廠；磷酸等均為分析純.

槲皮素(100081-201507)、山柰酚(110861-201504)、異鼠李素(110860-201406)三種對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所.

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm).流動(dòng)相：含0.04%磷酸的甲醇∶水=50∶50.流速：1 mL/min.檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm.柱溫：35 ℃.在此色譜條件下槲皮素、山奈酚、異鼠李素等3種成分均被洗脫出來(lái)，并且達(dá)到基線分離，見圖1.

2.2 溶液的制備[6]

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取對(duì)照品槲皮素2.24 mg、山柰酚1.41 mg、異鼠李素2.20 mg，將其分別置于5 mL的容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，再配制成一定濃度對(duì)照品溶液，使用時(shí)稀釋成所需要的濃度.

2.2.2 供試品Ⅰ溶液(未水解樣品)的制備

精密稱取1.0 g，加入甲醇10 mL，超聲提取45分鐘，抽濾.以甲醇洗滌濾渣3次，每次2 mL.濾渣重復(fù)上述操作，所得濾液與前一次濾液合并，濃縮后定容至50 mL.過0.45 μm濾膜，在所選定色譜條件下測(cè)定有效成分的含量.

2.2.3 供試品Ⅱ溶液(水解樣品)的制備

精密稱取1.0 g，加入甲醇10 mL，超聲提取45分鐘，抽濾，以甲醇洗滌濾渣3次，每次2 mL.濾渣重復(fù)上述操作，所得濾液與前一次濾液合并，濃縮一定體積后，加甲醇-25%鹽酸溶液(4∶1)混合液25 mL，回流30 min，放冷，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加入甲醇定容，過0.45 μm濾膜，在所選定色譜條件下測(cè)定有效成分的含量.

2.3 線性關(guān)系試驗(yàn)

分別精密量取3種對(duì)照品儲(chǔ)備液，用甲醇配制成濃度不同的混合對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)液系列溶液，每次進(jìn)樣10 μL，測(cè)定色譜峰面積的積分值.以峰面積積分值(A)為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo)，測(cè)得槲皮素、山奈酚、異鼠李素的回歸方程，見表1.

表1標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 檢測(cè)限

在選定的色譜條件下，當(dāng)信噪比S/N=3時(shí)，對(duì)各組分最低檢測(cè)限進(jìn)行測(cè)定.結(jié)果表明，測(cè)定槲皮素、山奈酚、異鼠李素含量的最低檢測(cè)限分別為0.25、0.38、1.2 ng.

2.5 精密度試驗(yàn)

在選定的色譜條件下，量取一定濃度的槲皮素、山奈酚和異鼠李素的混合對(duì)照品溶液，測(cè)定色譜峰的峰面積，計(jì)算得RSD分別為0.64%、0.49%、0.92%(n=6).

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

在選定的色譜條件下，精密稱取沙棘籽粕樣品0.5 g平行6份，分別加入甲醇10 mL，超聲提取45分鐘，抽濾.以甲醇洗滌濾渣3次，每次2 mL.濾渣重復(fù)上述操作，所得濾液與前一次濾液合并，濃縮后定容至50 mL.過0.45 μm濾膜，分別測(cè)定槲皮素、山奈酚、異鼠李素的含量，計(jì)算得RSD分別為1.4%、2.3%、2.7%(n=6).

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

在選定的色譜條件下，精密稱取沙棘籽粕樣品0.5 g，分別加入甲醇10 mL，超聲提取45分鐘，抽濾.以甲醇洗滌濾渣3次，每次2 mL.濾渣重復(fù)上述操作，所得濾液與前一次濾液合并，濃縮后定容至50 mL.過0.45 μm濾膜，在2 h、4 h、8 h、12 h、24 h時(shí)分別進(jìn)樣，計(jì)算槲皮素、山奈酚、異鼠李素的峰面積，計(jì)算得RSD分別為0.7%、0.9%、0.45%(n=5).表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好.

2.8 回收率試驗(yàn)

精密稱取5份已測(cè)知含量的沙棘籽粕樣品各0.5 g，添加各對(duì)照品溶液適量，按“2.2”方法操作，測(cè)得槲皮素、山奈酚、異鼠李素平均回收率(n=5)分別為100.7%、98.7%、99.6%；RSD分別為2.6%、3.1%、1.2%，結(jié)果見表2.

表2回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

2.9 樣品含量測(cè)定

在選定的色譜條件下，取“2.2”項(xiàng)下制備的樣品溶液，用DAD(二極管陣列)檢測(cè)器檢測(cè)上述3種待測(cè)組分的峰純度.待3種紫外光譜與對(duì)照品一致后，按外標(biāo)法，計(jì)算峰面積積分值，從而計(jì)算得3種有效成分的含量.每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)樣3次，取其平均值.含量測(cè)定結(jié)果見表3.

表3沙棘籽粕中3種有效成分的含量(%，n=3)

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

將對(duì)照品溶液進(jìn)樣后，利用DAD(二極管陣列)檢測(cè)器在波長(zhǎng)200～400 nm范圍掃描對(duì)照品溶液吸收光譜.3種對(duì)照品在238 nm波長(zhǎng)處均有較高的吸收，而且干擾比較小，因此選擇238 nm為檢測(cè)波長(zhǎng).

3.2 流動(dòng)相的選擇

經(jīng)過多次試驗(yàn)，3種有效成分色譜峰容易拖尾.當(dāng)水中加入0.04%磷酸時(shí)可改善3種有效成分峰的拖尾現(xiàn)象，因此選擇甲醇和含0.04%磷酸的水作流動(dòng)相.

3.3 結(jié)論

沙棘籽粕中黃酮類化合物主要有槲皮素、山奈酚、異鼠李素及其與各種糖形成的黃酮苷.水解與不水解樣品中各種組份的含量，發(fā)現(xiàn)水解與否對(duì)組份的含量的影響較小(見表3).為了簡(jiǎn)化操作步驟，可采用不經(jīng)水解直接測(cè)定的方法.

通過測(cè)定發(fā)現(xiàn)沙棘籽粕，仍含有較高的槲皮素、山奈酚、異鼠李素等黃酮類化合物.沙棘籽粕可作為制備黃酮化合物的中間體或原料，可進(jìn)一步提高沙棘籽粕的經(jīng)濟(jì)價(jià)值.

本文采用方法具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、可靠等特點(diǎn)，為沙棘籽粕的綜合利用提供了依據(jù).同時(shí)該方法可用于沙棘及其產(chǎn)品的質(zhì)量評(píng)價(jià).

[1] 張程慧，祁玉霞，程康蓉等.沙棘的綜合價(jià)值研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2017，38(21)：331-335.

[2] 郭興.利用沙棘果渣栽培黑木耳的研究[J].林業(yè)科技，2017，42(1)：42-44.

[3] 趙二勞，徐芬，尹愛萍等.沙棘果油與沙棘籽油脂肪酸組成及其抗氧化活性[J].中國(guó)油脂，2017，42(12)：120-123.

[4] 樊旭，周鴻立.沙棘黃酮含量的測(cè)定方法及其化學(xué)成分的研究進(jìn)展[J].北方園藝，2018，(06)：120-123.

[5] 劉勇，廉永善，王穎莉等.沙棘的研究開發(fā)評(píng)述及其重要意義[J]中國(guó)中藥雜志，2014，39(9)：1547-1551.

[6] 宋永朋，馬華麗. HPLC法測(cè)定白刺籽中槲皮素和山萘酚的含量[J].食品研究與開發(fā)，2015，36(20)：131-133.