李樹霞 孔慶暖 黃維清△ 甄宏偉 任永昌

(1青島大學醫(yī)學院,青島 266000；2臨沂市中心醫(yī)院,沂水 276410;3青島市立醫(yī)院,青島 266000)

乳腺癌是女性常見惡性腫瘤，統(tǒng)計顯示其發(fā)病率明顯上升，位于女性惡性腫瘤的第二位[1]，且發(fā)病越來越年輕化[2]。乳腺癌是激素依賴性腫瘤，多項研究表明雌激素在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起了重要作用[3-9]。核仁蛋白(Pescadillo，PES1)主要分布于細胞的核仁中，也少量分布于胞漿[10-11]。已有實驗證實PES1在胃癌和結腸癌中的表達水平升高[12]。早在2007年，Zhang H等[13]通過Western blot檢測到乳腺癌組織中PES1的表達明顯高于癌旁。最近研究報道顯示PES1在多種乳腺癌細胞系中的mRNA及蛋白表達水平都明顯升高，而且在臨床分期Ⅰ到Ⅳ期的原發(fā)性乳腺癌中均發(fā)現(xiàn)PES1表達水平顯著升高[11]。為乳腺癌治療及靶向藥物的研發(fā)提供新的思路和方向，本文將應用免疫組化方法檢測PES1蛋白在乳腺癌中的表達，分析PES1蛋白與乳腺癌組織雌激素受體(estrogenreceptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)及人表皮生長因子受體-2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)表達之間的關系，并結合患者年齡、病理分型、組織學分級等分析PES1蛋白表達與臨床病理特征之間的關系，以期發(fā)現(xiàn)PES1蛋白在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用。

1 資料和方法

1.1 一般資料

收集臨沂市中心醫(yī)院2015年12月30日至2016年5月23日手術切除乳腺癌的標本。所有蠟塊均常規(guī)中性福爾馬林固定，石蠟包埋，采用4μm連續(xù)切片， 經HE染色后，由兩名高年資病理診斷醫(yī)師進行讀片。選取病理診斷為浸潤性癌的60例石蠟標本作為實驗組，其中浸潤性癌，非特殊型36例，小葉癌22例，特殊類型癌2例，用癌旁組織作為對照。采用 Scarff-Bloom-Richardson 分級系統(tǒng)[14]，根據(jù)乳腺癌組織中腺管形成與否、細胞核的多形性、異型性和核分裂像3項指標進行分級，腺管形成的能力：1)整個腫瘤可看到為1分；2)不容易發(fā)現(xiàn)為3分；3)1分與3分之間為2分；細胞核的多形性：1)核規(guī)則、相當于乳腺上皮為1分；2)核明顯不規(guī)則，明顯多形和異型為3分；3)1分與 3分之間為2分；核分裂數(shù)(×400)：1)1/10 HPF為1分；2)2/10 HPF為2分；3)大于2/10 HPF為3分。 3 項指標的分數(shù)相加，Ⅰ級為3～5分，Ⅱ級為6～7 分，Ⅲ級為8～9 分。

1.2 主要儀器 和試劑

HM200 型切片機(MICROM公司，德國)、顯微鏡BX53(日本奧林巴斯)、一抗為兔多克隆抗體PES1(1∶200 Abcam公司 ab72539 )、單克隆兔抗人雌激素受體ER(1∶200基因科技 GT205607)、單克隆兔抗人孕激素受體PR(1∶200 基因科技 GT205707)、單克隆兔抗人C-erbB-2癌蛋白(1∶200 基因科技 GT210007)。

1.3 實驗方法

應用SP免疫組織化學染色法：石蠟切片脫蠟、水化，PBS沖洗3min×3次；非特異性染色劑阻斷10min，PBS緩沖液沖洗3min×3次 ；高溫高壓抗原修復； 3%H2O2去除內源性酶，加入動物血清封閉，加第一抗體，4℃冰箱過夜；PBS沖洗3min×3次；加聚合物增強劑(試劑A)，室溫下孵育20min； PBS沖洗3min×3次；加新配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察3～10min，陽性顯色為黃色；自來水沖洗，蘇木素復染，0.1%鹽酸分化，自來水沖洗，PBS沖洗返藍；梯度酒精脫水干燥，中性樹脂封片。

1.4 結果判定

1)PES1結果判定 隨機選取十個高倍鏡視野，計數(shù)陽性表達率，方法是計數(shù)陽性細胞的比率，取十個視野的平均數(shù)；評分標準：0分為陰性；1分為陽性表達率≤10%；2分為10%～50%；3分為50%～75%；4分﹥75%。根據(jù)染色強度評分：0分無棕黃色產物，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分棕褐色。最終評分為二者的乘積，以﹥3分定為免疫反應陽性[15]。

2)ER、PR、Ki67 結果判定 均采用細胞染色陽性的細胞數(shù)計算。ER、PR 結果參考 ASCO/CAP激素受體免疫組化檢測指南(2010 版)，ER、PR<1%腫瘤細胞著色為陰性；ER、PR≥1%腫瘤細胞著色為陽性。Ki67 的結果參考 St.Gallen 乳腺癌共識(2015)以20%為陽性截斷值。HER-2結果判定根據(jù)乳腺癌 HER-2 檢測指南(2014 版)[16]。0：無染色或≤10%的腫瘤細胞呈現(xiàn)不完整、微弱的細胞膜著色；1+：>10%的腫瘤細胞呈現(xiàn)不完整的、微弱的細胞膜染色；2+：>10%的腫瘤細胞呈現(xiàn)不完整和或弱至中等強度的細胞膜染色或≤10%的腫瘤細胞呈現(xiàn)強而完整的細胞膜染色；3+：>10%的腫瘤細胞呈現(xiàn)強而完整的細胞膜染色。分子亞型參考 St.Gallen 乳腺癌共識(2015)根據(jù)乳腺癌組織ER、PR、HER-2的表達分為：Luminal A型(ER+，和/或 PR+，HER-2-)；Luminal B型(①ER+，和/或PR+，HER-2+，Ki67任何水平；②ER+，和/或PR+，HER-2-，Ki67≥20%)；HER-2過表達型(ER-，PR-，HER-2+)；三陰性(ER-，PR-，HER-2-)。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結果

2.1 PES1在乳腺癌組織中表達情況

PES1 主要在乳腺癌組織的細胞核中表達，陽性表達時細胞核著色為棕黃色，可呈局部密集分布或彌散分布(圖1)。PES1在乳腺癌組織中的表達顯著高于癌旁組織，有統(tǒng)計學意義(表1)。

注：A為乳腺癌組織，B為癌旁組織

2.2 PES1與乳腺癌臨床病理特征的關系

本文結果表明PES1蛋白的表達與患者年齡，乳腺癌病理分型及組織學學分級均無相關性。見表2。

2.3 PES1與ER、PR、HER-2和Ki67 的關系分析

ER陽性組中，PES1 陽性表達率為90.9%(40/44)，ER陰性組中，PES1陽性表達率為50.0%(8/16)，PES1的表達水平與ER具有關聯(lián)性，PES1的表達水平與乳腺癌孕激素受體、HER-2和Ki67的表達無關。見表3。

表2 PES1與臨床病理特征之間的關系(n)

表3 PES1與ER、PR、HER-2和Ki67 的關系分析(n)

2.4 PES1與乳腺癌分子亞型的關系

本文結果顯示PES1蛋白表達與乳腺癌分子亞型無關。見表4。

表4 PES1與乳腺癌分子亞型的關系分析(n)

3 討論

乳腺癌是一種發(fā)生在乳腺腺上皮細胞的常見惡性腫瘤，近年來發(fā)病率迅速上升，嚴重威脅著女性的健康，乳腺癌具有發(fā)病率高和死亡率高的特點，所以乳腺癌的預防和治療是國內外均急需解決的迫切問題。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是多基因、多因素和多階段參與的過程，腫瘤細胞的生物學行為及發(fā)生發(fā)展過程受諸多因素影響。目前雖然已知乳腺癌發(fā)病機制與ER、PR、HER-2等信號通路密切相關，但其具體分子生物學機制尚未明確，對乳腺癌發(fā)病機制的深入探討不僅可以幫助我們理解腫瘤的發(fā)生發(fā)展特點，還可以通過發(fā)現(xiàn)新的生物學靶點為靶向藥物的研制提供方向。

PES1 蛋白是一種新近發(fā)現(xiàn)的重要的核仁蛋白。研究發(fā)現(xiàn)其參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，PES1基因如突變或缺陷，可導致細胞周期阻滯[17]。近年來，人們越來越多的關注到PES1在諸多腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮的作用[18-19]，并發(fā)現(xiàn)PES1在乳腺癌中有表達。April H用雌激素(E2)刺激人乳腺癌細胞的實驗方法進行的基因篩查，發(fā)現(xiàn)表達顯著變化的基因中存在PES1并且證明PES1在乳腺癌中表達可能受到雌激素水平的影響，進一步說明PES1與乳腺癌的發(fā)生有著密切關系。研究表明[20]，ERα陽性的乳腺癌細胞中，PES1的轉錄活性與ERα的蛋白表達呈正相關而與ERβ的蛋白表達呈負相關，有可能PES1通過ER調節(jié)參與 E2信號通路的調控。本文我們對于PES1的表達水平和ER有關聯(lián)性，并且PES1的表達明顯高于癌旁組織，PES1蛋白可能通過參與ER激素受體通路促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展及增殖。

本文結果表明，乳腺癌組織PES1陽性表達48例(80.0%)，癌旁組織PES1陽性表達32例(53.3%)，PES1癌組織表達顯著高于癌旁組織(P=0.02)。本文結果與2007年Zhang等[13]通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中PES1的表達明顯高于癌旁的結果相符合。我們分析了PES1蛋白表達與臨床病理參數(shù)間的關系，結果表明PES1蛋白的表達水平與患者年齡、病理分型及組織學分級均無關。同時本文結果還表明， PES1蛋白的表達水平與乳腺癌分子亞型無關。而在研究PES1蛋白與激素受體關系時結果顯示， ER陽性組中，PES1 陽性表達率為90.9%，ER陰性組中，PES1陽性表達率為50.0%，PES1的表達水平與ER具有關聯(lián)性，PES1的表達水平與乳腺癌PR、HER-2和Ki67的表達無關。我們的研究結果不僅進一步證實了PES1蛋白在乳腺癌組織中的高表達，而且在腫瘤組織中證實了PES1蛋白與ER受體表達有關聯(lián)性，結果表明PES1蛋白可能通過參與ER通路在乳腺癌組織的發(fā)病機制中起到重要作用。

總之，本文通過免疫組化方法檢測乳腺癌組織中PES1蛋白的表達及與臨床病理特征、激素受體之間的關系進一步明確了PES1蛋白促進腫瘤細胞增殖的重要作用，同時通過PES1蛋白與ER受體的正相關性我們推測PES1蛋白可能通過參與ER相關通路參與乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展，也為靶向藥物的研發(fā)提供新的思路。

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