謝鳳鳳，李鵬，黎理，朱華#，尚小紅，李平鳳（.廣西中醫(yī)藥大學(xué)科學(xué)實驗中心，南寧53000；.廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點開放實驗室，南寧 530007）

隨著現(xiàn)代遺傳分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，其在種質(zhì)遺傳多樣性評價與親緣關(guān)系分析、種質(zhì)資源鑒定、指紋圖譜與分子連鎖圖譜構(gòu)建、基因表達差異、分子標(biāo)記輔助育種以及功能基因克隆等方面的應(yīng)用[1]逐漸成為熱點。分子標(biāo)記技術(shù)有數(shù)十種之多，隨著研究目的不同，需要選擇相適應(yīng)的標(biāo)記方法?；蜷g隔區(qū)2-限制性DNA片段長度多態(tài)性（IGS2-RFLP）、簡單重復(fù)序列（ISSR）與目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性（SCoT）標(biāo)記是常見的3種分子標(biāo)記技術(shù)。其中，SCoT分子標(biāo)記作為一種新型的目的基因分子標(biāo)記技術(shù)，其引物設(shè)計簡單、通用性好，其產(chǎn)物可使用瓊脂糖凝膠電泳檢測，操作更加簡便，且條帶多態(tài)性高、有豐富的遺傳信息[2]。近5年關(guān)于SCoT分子標(biāo)記的文獻已逾300篇，主要是將其應(yīng)用于遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析[3]、反應(yīng)體系優(yōu)化[4]、指紋圖譜分析[5]等方面的報道，表明SCoT分子標(biāo)記的手段日趨成熟，可廣泛應(yīng)用于多種植物的種質(zhì)資源鑒定、遺傳信息分析等研究。

廣西產(chǎn)拳卷地錢來源于地錢科地錢屬植物拳卷地錢（Marchantia convolutaGao et Chang），始載于《西藏苔蘚植物志》，是苔蘚植物中常用的中草藥之一[6]。其常用于外治燙傷骨折、體癬、瘡病不斂，內(nèi)治黃疸性肝炎，獲得了較好的療效[7-8]。廣西壯族自治區(qū)地處熱帶及亞熱帶地區(qū)，且地形以山地為主、海拔較高，因此地錢屬（MarchantiaL.）植物品種資源在這一地區(qū)分布頗多。資源調(diào)查情況和生藥學(xué)鑒定結(jié)果顯示，廣西境內(nèi)地錢屬植物主要有地錢（M.polymorpha）、拳卷地錢（M.convolutaGao et Chang）和粗裂地錢（M.paleacea）3種[9]，尤以拳卷地錢的資源最為豐富。目前關(guān)于拳卷地錢的分子遺傳學(xué)研究極少，為了更好地開發(fā)利用廣西這一特色優(yōu)勢藥材資源，確保其基源的準(zhǔn)確性，本課題組提取了拳卷地錢的DNA，以其為模板篩選SCoT-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）體系的引物，并優(yōu)化反應(yīng)體系條件，為拳卷地錢的品種鑒定及資源開發(fā)提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

DYY-6C型核酸電泳儀（北京市六一儀器廠）；JS-1075型凝膠成像分析系統(tǒng)（上海培清科技有限公司）；ABI-2720型PCR儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；Lambda265型紫外分光光度計（美國珀金埃爾默儀器有限公司）；BP211D型電子分析天平（德國賽多利斯公司）；H1850R型臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；HH-S4型恒溫水浴箱（上海一恒科技有限公司）。

1.2 試劑與引物

十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）抽提液（北京雷根生物技術(shù)有限公司，批號：NE0012-500mL）；kb DNA Ladder（批號：M1400-100T）、GoldView核酸染色劑（批號：G8140）均購自北京索萊寶科技有限公司；EX Taq酶套裝（含Taq DNA聚合酶、Buffer、dNTP）及DL Marker 2000、GelRed試劑均購自寶生物工程（大連）有限公司。

引物參照文獻[10]中的36條SCoT引物序列（見表1），均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 36條SCoT引物序列Tab 1 Sequences of 36 SCoT primers

1.3 藥材

拳卷地錢幼嫩葉狀體于2017年5月22日采自廣西來賓金秀鎮(zhèn)六拉沖村，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室韋松基教授鑒定為拳卷地錢（M.convolutaGao et Chang）原植物。將藥材洗凈后于-20℃保存，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 拳卷地錢藥材樣品DNA提取及濃度測定

采用文獻[11]中的改良CTAB法提取拳卷地錢藥材樣品的DNA。采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA純度，設(shè)定電壓為110 V、運行時間為30 min（以下凝膠電泳試驗均設(shè)置相同條件）；然后經(jīng)GoldView核酸染色劑染色，在凝膠成像分析系統(tǒng)上成像。采用紫外分光光度法，于260、280 nm處分別測定吸光度（A），用吸光度比值（A260/A280）表示DNA濃度。

凝膠電泳結(jié)果顯示，樣品DNA條帶整齊，無RNA污染、無降解、無彌散熒光，加樣孔清晰，表明所提取的樣品DNA純度較高；紫外分光光度法測定結(jié)果顯示，樣品DNA的A260/A280值為2.053（在1.8～2.0范圍內(nèi)），表明所提取的樣品DNA濃度較高[11]。將樣品DNA稀釋至適當(dāng)濃度，以備后續(xù)試驗使用。

2.2 SCoT引物篩選

以樣品DNA為模板，參考文獻[12]的條件對36條SCoT引物進行PCR擴增反應(yīng)，參照“2.1”項下方法對PCR產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳、染色、成像，結(jié)果見圖1。

由圖1可見，編號為4、6、7、12、20、23、24、25、31、33、34、35的12條引物所得產(chǎn)物條帶整齊、明亮，無彌散熒光；編號為2、5、8、9的4條引物所得產(chǎn)物的條帶清晰、整齊、數(shù)量多，無彌散熒光；其余20條引物所得產(chǎn)物條帶清晰度欠佳、不成條帶，有明顯的彌散熒光，表明產(chǎn)物降解明顯。本課題組選擇產(chǎn)物亮度最高的4號引物進行PCR擴增反應(yīng)體系的優(yōu)化試驗。

2.3 SCoT-PCR擴增體系優(yōu)化

2.3.1 正交試驗 相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，DNA濃度、Mg2+濃度、dNTP濃度、引物濃度、Taq DNA聚合酶濃度（酶濃度以其活力單位U/mL表示）5個因素對SCoT-PCR反應(yīng)體系有顯著影響[2]，因此本課題組對上述影響擴增反應(yīng)的5個主要因素（分別以因素A、B、C、D、E表示）進行5因素4水平的正交設(shè)計，按L16（45）正交表篩選最佳擴增反應(yīng)體系。以“2.1”項下獲得的樣品DNA為模板，采用“2.2”項下篩選的4號引物進行PCR反應(yīng)，總反應(yīng)體積為20μL。擴增條件：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，50℃退火1 min，72℃延伸90 s，35個循環(huán)；72℃再延伸5

圖1 36條引物擴增電泳圖Fig 1 Amplification electrophoresis figure of 36 primers

min。參照“2.1”項下方法對PCR產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳、染色、成像。采用直觀分析法[13]對成像后的產(chǎn)物擴增條帶的清晰度、數(shù)目、亮度及背景干凈程度進行評分[評分范圍為1～16分，成像效果最好者（條帶數(shù)目多、亮度強、背景清晰、無拖帶雜帶）得16分，效果最差者得1分，其余按照成像效果依次排序評分]，并對評分結(jié)果進行統(tǒng)計分析。正交試驗因素與水平見表2，正交試驗設(shè)計和結(jié)果見表3，擴增產(chǎn)物的凝膠電泳圖見圖2。

表2 因素與水平Tab 2 Factors and levels

由圖2可知，不同因素和水平組合的擴增反應(yīng)體系所得產(chǎn)物在條帶數(shù)、清晰度和亮度方面均有差異；由表3可知，1～16號試驗的擴增反應(yīng)產(chǎn)物評分值分別為9、14、7、10、2、6、11、16、3、8、4、15、5、1、12、13。

2.3.2 正交試驗結(jié)果分析 根據(jù)表3中的R值可知，各因素對擴增反應(yīng)影響程度排序為Mg2+濃度（B）＞Taq DNA聚合酶濃度（E）＞dNTP濃度（C）＞DNA濃度（A）＞引物濃度（D）。根據(jù)表3中評分結(jié)果平均值可知，當(dāng)DNA濃度為30 μg/mL時，所得產(chǎn)物評分的平均值10.00為最高；當(dāng)Mg2+濃度為2.00 mmol/L時，所得產(chǎn)物評分的平均值13.50為最高；當(dāng)dNTP濃度為0.20 mmol/L時，所得產(chǎn)物評分的平均值10.75為最高；當(dāng)引物濃度為0.40 μmol/L時，所得產(chǎn)物評分的平均值9.75為最高；當(dāng)TaqDNA聚合酶濃度為0.50 U/mL時，所得產(chǎn)物評分的平均值11.25為最高。綜上，最優(yōu)SCoT-PCR擴增反應(yīng)體系確定為A1B4C2D2E1，即30.00 μg/mL DNA、2.00 mmol/L Mg2+、0.20 mmol/L dNTP、0.40 μmol/L引物、0.50 U/mL Taq DNA聚合酶（總反應(yīng)體積20 μL）。

表3 正交試驗設(shè)計與結(jié)果Tab 3 Orthogonal design and result

圖2 SCoT-PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig 2 Electrophoretic diagram of SCoT-PCR amplifi cation products

3 討論

IGS2-RFLP、ISSR、SCoT這3種分子標(biāo)記技術(shù)均可用于親緣關(guān)系分析、基因表達差異、分子標(biāo)記輔助育種等方面的研究，但三者的區(qū)別主要在于：IGS2-RFLP構(gòu)建指紋圖譜優(yōu)勢更為明顯，準(zhǔn)確性和可重復(fù)性大大優(yōu)于ISSR，但其多態(tài)性檢測效率略低于ISSR；而對育種材料進行遺傳多樣性分析時，SCoT和ISSR所得產(chǎn)物多態(tài)性高、信息量大，能均勻地覆蓋整個基因組，但SCoT由于本身可能是目的基因的一部分或與目的基因緊密連鎖，在育種時篩選可利用性狀的效用會高于ISSR[14]。

關(guān)于拳卷地錢的分子標(biāo)記分析僅見于ISSR-PCR反應(yīng)體系的研究[15]。本課題組以SCoT法對拳卷地錢DNA進行標(biāo)記，并采用正交試驗對SCoT-PCR反應(yīng)體系進行優(yōu)化，對各影響因素進行綜合分析。不同因素同一水平試驗結(jié)果的平均值反映了影響因素各水平對反應(yīng)體系的影響程度，平均值越高，表明采用該水平的反應(yīng)體系效果越好；R值則反映了各影響因素對反應(yīng)體系的影響程度，R值越大，表明該因素影響越明顯。本研究結(jié)果顯示，各因素對SCoT-PCR擴增反應(yīng)的影響程度排序為Mg2+濃度＞Taq DNA聚合酶濃度＞dNTP濃度＞DNA濃度＞引物濃度；其中Mg2+濃度和Taq DNA聚合酶濃度結(jié)果的R值分別為8.75和7.00，在5個因素中排前2位，表明這2個因素對試驗結(jié)果的影響最為顯著，故試驗過程中應(yīng)特別注意對這2個因素的設(shè)置。

綜上所述，本研究所優(yōu)化的DNA的SCoT-PCR反應(yīng)體系，可為廣西產(chǎn)拳卷地錢品種鑒定、遺傳多樣性評價及親緣關(guān)系分析提供技術(shù)支持，進而為該藥材的資源開發(fā)利用提供實驗基礎(chǔ)。

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