楊雪梅，李俊，譚宇哲，王新雪，宋亞曼

（河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)科，河北 石家莊 050031)

精子細(xì)胞成熟為精子時(shí)，核內(nèi)組蛋白被過渡蛋白取代，而后過渡蛋白又被魚精蛋白取代，形成環(huán)形染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。DNA包裹程度加強(qiáng)，染色質(zhì)凝集水平可達(dá)體細(xì)胞的6倍，這種特殊的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)可在精子游行于生殖道時(shí)保護(hù)父源基因組信息[1]。核蛋白成熟度是評(píng)價(jià)染色質(zhì)凝集程度的重要參數(shù)，可作為評(píng)價(jià)受精及妊娠的預(yù)測(cè)指標(biāo)[2]。常規(guī)精液檢查是評(píng)估男性生育力的重要依據(jù)，精液體積、精子濃度、精子總數(shù)、前向運(yùn)動(dòng)精子比例及正常形態(tài)精子等參數(shù)常用來評(píng)估精液質(zhì)量，通常認(rèn)為常規(guī)精液參數(shù)與受精能力存在相關(guān)性[3]。目前，精子核蛋白成熟度與常規(guī)精液參數(shù)的相關(guān)性尚無定論，本研究旨在明確精子核蛋白成熟度與精液體積、精子濃度、精子總數(shù)、前向運(yùn)動(dòng)精子比例及正常形態(tài)精子比例等常規(guī)參數(shù)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本

選取2013年12月-2014年12月該院就診的371例不育男性患者精液樣本?；颊咂骄挲g（30.30±5.76）歲，無精癥患者除外，無遺傳病家族史。依據(jù)精子核蛋白成熟度分為正常組（156例）和異常組（215例）。

1.2 儀器與試劑

精液計(jì)算機(jī)輔助分析系統(tǒng)由北京偉力公司生產(chǎn)，Diff-Quick染液和精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換試劑盒購(gòu)于深圳博銳德生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 精液常規(guī)分析 嚴(yán)格按照世界衛(wèi)生組織第5版人類精液實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)[4]行標(biāo)本檢測(cè)。患者禁欲2～7 d，手淫法將精液標(biāo)本完全收集于廣口采集杯中，并置于37℃水浴鍋中，待標(biāo)本液化后測(cè)量pH值、稱量精液體積。使用計(jì)算機(jī)輔助分析系統(tǒng)檢測(cè)精子濃度、前向運(yùn)動(dòng)精子比例等參數(shù)。采用Diff-Quick法行精子染色，分析正常形態(tài)精子比例。

1.3.2 精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換檢測(cè) 精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換采用苯胺藍(lán)染色法（深圳博銳德公司）分析精子核蛋白成熟度，操作步驟詳見試劑盒說明書。正常參考值為核蛋白成熟度≥70%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩獨(dú)立樣本采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson法。以各精液參數(shù)為檢驗(yàn)變量，以核蛋白成熟度（正?；虍惓＃闋顟B(tài)變量，使用MedCalc數(shù)據(jù)分析軟件（V15.8）繪制受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve, ROC），檢驗(yàn)變量曲線下面積（area under the cure,AUC），比較采用Z檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 精子核蛋白成熟度正常組和異常組精液參數(shù)的比較

比較兩組各精液參數(shù)的差異，結(jié)果顯示，兩組的精子濃度、精子總數(shù)、前向運(yùn)動(dòng)精子比例及正常形態(tài)精子比例比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見附表。

2.2 核蛋白成熟度與常規(guī)精液參數(shù)的關(guān)系

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，核蛋白成熟度與精子濃度（r=0.335，P=0.000）、精子總數(shù)（r=0.346，P=0.000）、前向運(yùn)動(dòng)精子比例（r=0.240，P=0.000）及正常形態(tài)精子比例（r=0.260，P=0.000）呈正相關(guān)。見圖1。

附表 核蛋白成熟度正常組和異常組各精液參數(shù)的比較 （±s）

附表 核蛋白成熟度正常組和異常組各精液參數(shù)的比較 （±s）

正常形態(tài)精子比例/%核蛋白成熟度正常組（n =156，≥70%） 4.05±1.46 168.86±93.95 659.08±382.09 43.81±15.02 6.71±3.29核蛋白成熟度異常組（n =215，＜70%） 3.87±1.40 115.05±78.00 428.08±309.99 38.51±16.64 5.38±3.24 t值 -1.196 -5.878 -6.254 -3.213 -1.196 P值 0.232 0.000 0.000 0.001 0.000組別 體積/ml 精子濃度/（×106個(gè) /ml）精子總數(shù)/（×106個(gè))前向運(yùn)動(dòng)比例（%）

2.3 精液常規(guī)參數(shù)對(duì)核蛋白成熟度的預(yù)測(cè)價(jià)值

精子濃度 [AUC=0.679（95%CI：0.625，0.734），P=0.000]、精子總數(shù) [AUC=0.691（95%CI：0.636，0.746），P=0.000]、前向運(yùn)動(dòng)精子比例[AUC=0.594（95%CI：0.536，0.652），P=0.002]及正常形態(tài)精子比例[AUC=0.624（95%CI：0.567，0.681），P=0.000]均大于機(jī)會(huì)參考線下面積（見圖2），提示精液常規(guī)參數(shù)可預(yù)測(cè)核蛋白成熟度。精子濃度、精子總數(shù)的臨界值分別為 124.02×106個(gè) /ml、421.72×106個(gè) /ml，前向運(yùn)動(dòng)精子比例、正常形態(tài)精子比例的臨界值分別為35.27%、5.00%；敏感性分別為63.33%、62.38%、46.47%及62.11%；特異性分別為65.22%、70.81%、74.53%及62.11%。綜合敏感性和特異性2個(gè)指標(biāo)后，精子總數(shù)預(yù)測(cè)核蛋白成熟度的準(zhǔn)確性最高。

圖1 核蛋白成熟度與常規(guī)精液參數(shù)的相關(guān)性分析

圖2 常規(guī)精液參數(shù)對(duì)核蛋白成熟度的預(yù)測(cè)價(jià)值

3 討論

據(jù)報(bào)道，全世界有15%的夫婦患有不孕不育癥，其中男性因素造成的不育約占50%[5]。對(duì)各項(xiàng)預(yù)測(cè)生育力指標(biāo)的準(zhǔn)確分析是不育癥診斷和治療的基礎(chǔ)。常規(guī)精液分析是探索男性不育的基本手段，核蛋白成熟度是近年來發(fā)現(xiàn)衡量精子功能的重要指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，精子染色質(zhì)成熟度可影響胚胎發(fā)育[6]，精子染色質(zhì)凝集異常比例升高時(shí)流產(chǎn)率升高[7]。

精子發(fā)生過程中，精子核完全重組，經(jīng)歷以染色質(zhì)凝集為特征的重排，染色質(zhì)凝集過程包括組蛋白被過渡蛋白取代，過渡蛋白被堿性魚精蛋白取代，魚精蛋白與精子核DNA緊密結(jié)合成為高度凝集的染色質(zhì)。基于苯胺藍(lán)染色的核蛋白成熟度檢測(cè)可有效評(píng)估精子染色質(zhì)致密化情況，苯胺藍(lán)可使富含賴氨酸的組蛋白染色。精子核中組蛋白含量的升高說明組蛋白-過渡蛋白-魚精蛋白取代異常，影響DNA鏈折疊，使DNA碎片比例升高，導(dǎo)致精子受精能力下降[8]。

目前，精子核蛋白成熟度與精子濃度、活力的關(guān)系尚無定論。研究發(fā)現(xiàn)，前向運(yùn)動(dòng)精子比例與核蛋白成熟異常呈負(fù)相關(guān)[9]；弱精癥患者核蛋白組型轉(zhuǎn)換異常率高于正?；盍M[10]。精子總數(shù)、活動(dòng)力與魚精蛋白含量缺乏呈負(fù)相關(guān)[3]；精子核蛋白對(duì)魚精蛋白比例與精子活力、存活、濃度及總數(shù)呈負(fù)相關(guān)[11]，精子核蛋白成熟異常與精子總數(shù)、前向運(yùn)動(dòng)率降低密切相關(guān)[12]。本研究結(jié)果顯示，精子核蛋白成熟度與精子濃度、總數(shù)及前向運(yùn)動(dòng)精子比例呈正相關(guān)，與上述結(jié)論一致。但也有報(bào)道認(rèn)為精子核蛋白成熟度是影響男性不育的獨(dú)立因素，與精子濃度、活力無關(guān)[2，13]，分析樣本量、分組標(biāo)準(zhǔn)及檢測(cè)方法可能是導(dǎo)致結(jié)果差異的原因。本實(shí)驗(yàn)顯示核蛋白成熟度與正常形態(tài)精子比例呈正相關(guān)，與前人研究一致[14-16]，說明精子形態(tài)異?？赡苁怯删雍酥旅芑怀浞衷斐伞?/p>

ROC曲線分析表明，精子濃度、前向運(yùn)動(dòng)精子比例、精子總數(shù)及正常形態(tài)精子比例可在一定程度上預(yù)測(cè)核蛋白成熟度，說明精子發(fā)生是一連續(xù)過程，核蛋白成熟度降低造成的染色質(zhì)凝集異?？蛇M(jìn)一步影響精子濃度、精子總數(shù)、前向運(yùn)動(dòng)精子比例及正常形態(tài)精子比例等常規(guī)精液參數(shù)，而精液參數(shù)的異常又可反映染色質(zhì)凝集不充分，其參與調(diào)控的細(xì)胞及分子生物學(xué)機(jī)制有待于進(jìn)一步探討。

綜上所述，本研究表明精子核蛋白成熟度與常規(guī)精液參數(shù)具有相關(guān)性，常規(guī)精液參數(shù)可在一定程度上預(yù)測(cè)核蛋白成熟度是否正常。

[1]FRANCIS S, YELUMALAI S, JONES C, et al. Aberrant protamine content in sperm and consequential implications for infertility treatment[J]. Hum Fertil, 2014, 17(2): 80-89.

[2]SELLAMI A, CHAKROUN N, BEN ZARROUK S, et al.Assessment of chromatin maturity in human spermatozoa: useful aniline blue assay for routine diagnosis of male infertility[J]. Adv Urol, 2013, 2013(4): 578631.

[3]IRANPOUR F G. Impact of sperm chromatin evaluation on fertilization rate in intracytoplasmic sperm injection[J]. Adv Biomed Res, 2014, 3(1): 229.

[4]World Health Organization. WHO laboratory mannual for the examination and processing of human semen[M]. New York.Cambridge University Press: 2010.

[5]FANG J, WANG S, WANG H, et al. The Cytochrome P4501A1 gene polymorphisms and idiopathic male infertility risk: a metaanalysis[J]. Gene, 2014, 535(2): 93-96.

[6]鄭九嘉, 肖仕金, 楊旭, 等. 精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換與精液參數(shù)、胚胎發(fā)育的相關(guān)性分析[J]. 中華泌尿外科雜志, 2013, 34(9):694-698.

[7]MOHAMED E E, MOHAMED M A. Effect of sperm chromatin condensation on the outcome of intrauterine insemination in patients with male factor infertility[J]. J Reprod Med, 2012,57(9/10): 421-426.

[8]SATI L and HUSZAR G. Methodology of aniline blue staining of chromatin and the assessment of the associated nuclear and cytoplasmic attributes in human sperm[J]. Methods Mol Biol,2013, 927(927): 425-436.

[9]KAZEROONI T, ASADI N, JADID L, et al. Evaluation of sperm's chromatin quality with acridine orange test, chromomycin A3 and aniline blue staining in couples with unexplained recurrent abortion[J]. J Assist Reprod Genet, 2009, 26(11/12): 591-596.

[10]周宇林, 陳康, 余波瀾, 等. 吸煙對(duì)男性不育患者精子核蛋白成熟度的影響[J]. 中華男科學(xué)雜志, 2013, 19(9): 794-797.

[11]YU B, QI Y, LIU D, et al. Cigarette smoking is associated with abnormal histone-to-protamine transition in human sperm[J].Fertil Steril, 2014, 101(1): 51-57.

[12]孫永. 男性不育患者精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)與分析[J].山東醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校學(xué)報(bào), 2013, 35(5): 367-369.

[13]劉居理, 羅明, 盧雪芳, 等. 男性不育患者精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換與精子密度及活力分析[J]. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床, 2009, 6(13):1061-1062.

[14]UTSUNO H, MIYAMOTO T, OKA K, et al. Morphological alterations in protamine-deficient spermatozoa[J]. Hum Reprod,2014, 29(11): 2374-2381.

[15]ZINI A, PHILLIPS S, COURCHESNE A, et al. Sperm head morphology is related to high deoxyribonucleic acid stainability assessed by sperm chromatin structure assay[J]. Fertil Steril, 2009,91(6): 2495-2500.

[16]BOITRELLE F, FERFOURI F, PETIT J M, et al. Large human sperm vacuoles observed in motile spermatozoa under high magnification: nuclear thumbprints linked to failure of chromatin condensation[J]. Hum Reprod, 2011, 26(7): 1650-1658.