常艷華，梁加貝，周志毅，蔡穎

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫市人民醫(yī)院 病理科，江蘇 無(wú)錫 214023）

乳腺癌是威脅女性健康的常見惡性腫瘤，其發(fā)病率在全世界呈上升趨勢(shì)。臨床上治療乳腺癌的常見方法是手術(shù)切除和輔助化療，由于乳腺癌容易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，給治療帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)。腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是由多種復(fù)雜因素造成的，其中，腫瘤組織中新生血管數(shù)量的增加，為腫瘤組織的生長(zhǎng)提供了必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使腫瘤得以快速生長(zhǎng)，導(dǎo)致腫瘤易復(fù)發(fā)、易轉(zhuǎn)移的重要因素之一。

FOXO3a是FOX蛋白家族的重要成員，在哺乳動(dòng)物的多種器官的細(xì)胞中均有表達(dá)。有研究表明[1]，F(xiàn)OXO3a轉(zhuǎn)錄因子可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移及新生血管的形成。由此提出假設(shè)，F(xiàn)OXO3a可能抑制乳腺癌組織中新生血管形成，進(jìn)而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。本研究通過檢測(cè)乳腺癌組織中FOXO3a的表達(dá)，分析其亞細(xì)胞定位與腫瘤內(nèi)微血管密度的關(guān)系，探討其在乳腺癌新生血管形成中可能存在的作用和意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2014年1月-2014年12月南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫市人民醫(yī)院乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者的癌組織（乳腺癌組）及相應(yīng)癌旁＞2 cm的組織（癌旁組）各102例。所有病例經(jīng)病理證實(shí)，且術(shù)前均未接受過放療、化療及生物學(xué)治療。

1.2 試劑

FOXO3a兔抗人單克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology（CST，#12829，稀釋度 1 ：100），CD34 鼠抗人單克隆抗體購(gòu)自福州邁新公司（MAB-0034），EnVision試劑盒和DAB顯色劑購(gòu)自福州邁新公司。

1.3 方法

石蠟包埋組織，4 μm厚切片，分別行HE染色和免疫組織化學(xué)（簡(jiǎn)稱免疫組化）染色（采用EnVision兩步法）。實(shí)驗(yàn)均設(shè)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。FOXO3a陽(yáng)性定位于細(xì)胞核/質(zhì)；CD34定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜/質(zhì)，將CD34陽(yáng)性的內(nèi)皮細(xì)胞形成的管狀、窄裂隙狀、囊狀和空泡狀的結(jié)構(gòu)，判定為可計(jì)數(shù)的微血管。微血管密度（microvessel density，MVD）計(jì)數(shù)采WEIDNER[2]的方法，先于低倍（100倍）光鏡下確定至少5個(gè)脈管著色最密集的區(qū)域，然后在高倍（400倍）光鏡下計(jì)數(shù)目標(biāo)區(qū)域的微血管數(shù)，取計(jì)數(shù)最高的3個(gè)視野的均值作為該標(biāo)本的MVD。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；比較用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FOXO3a在乳腺癌組及癌旁組的表達(dá)

FOXO3a在乳腺癌組表達(dá)的總陽(yáng)性率為70.59%（72/102），72例陽(yáng)性病例中有7例僅細(xì)胞核陽(yáng)性，56例僅細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性，9例細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)均陽(yáng)性；癌旁組表達(dá)的總陽(yáng)性率為84.31%（86/102），86例陽(yáng)性病例中有71例僅細(xì)胞核陽(yáng)性，3例僅細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性，12例細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)均陽(yáng)性；乳腺癌組FOXO3a總陽(yáng)性率低于癌旁組（χ2=5.501，P=0.019）；乳腺癌組及癌旁組FOXO3a在細(xì)胞核表達(dá)的陽(yáng)性率分別為15.69%（16/102）和81.37%（83/102），在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)的陽(yáng)性率分別為63.73%（65/102）和14.71%（15/102）；兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2胞核=88.096，P=0.000；見圖1 和附表。

2.2 兩組MVD值及其與FOXO3a在乳腺癌組織中亞細(xì)胞定位的關(guān)系

兩組MVD的水平分別為（27.46±5.87）和（17.25±3.61），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=22.224，P=0.000）。見圖2。乳腺癌組織中胞核FOXO3a陽(yáng)性者M(jìn)VD的水平（23.19±4.00）低于胞核FOXO3a陰性者（28.24±5.84）（t=3.314，P=0.001）；而胞質(zhì)FOXO3a陽(yáng)性者M(jìn)VD的水平（26.39±3.12）與FOXO3a陰性者（27.90±4.37）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.827，P=0.795）。

圖1 兩組FOXO3a的表達(dá) （免疫組化）

附表 兩組FOXO3a的表達(dá)比較 [n =102，例（%）]

圖2 兩組CD34的表達(dá) （免疫組化）

3 討論

Forkhead轉(zhuǎn)錄因子是2000年被正式命名的新轉(zhuǎn)錄因子家族，該家族龐大，有17個(gè)亞家族，其中對(duì)FOXO亞家族的研究最為深入。目前在哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)的FOXO家族成員有4個(gè)，為FOXO1、FOXO3a、FOXO4和FOXO6，其在細(xì)胞增殖、分化及凋亡等方面起重要作用[3-5]。FOXO3a廣泛表達(dá)于人的胃、結(jié)腸、直腸、肝、肺、乳腺和前列腺等各種組織器官中，作為重要的轉(zhuǎn)錄因子參與多種生理病理過程，調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、氧化應(yīng)激及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)等過程[6-8]。

FOXO3a是胰島素PI3K-Akt信號(hào)通路的重要作用底物。胰島素樣生長(zhǎng)因子能誘導(dǎo)PI3K/Akt級(jí)聯(lián)反應(yīng)，蛋白激酶B（protein kinase B, AKT）可使FOXO3a磷酸化，磷酸化后的FOXO3a與核DNA親和力下降，而與伴侶蛋白14-3-3的親和力增加，F(xiàn)OXO3a/14-3-3蛋白結(jié)合體從細(xì)胞核轉(zhuǎn)位至細(xì)胞質(zhì)，并阻止復(fù)合物逆轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)，F(xiàn)OXO3a滯留于細(xì)胞質(zhì)中，無(wú)法激活下游的靶因子，而失去活性[9-10]。多個(gè)研究表明PI3K/Akt/FOXO3a信號(hào)通路參與乳腺癌的發(fā)生[11-12]，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO3a的活性高低、亞細(xì)胞定位以及參與的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路均與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO3a在乳腺癌組的表達(dá)低于癌旁組，且FOXO3a主要表達(dá)于乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，提示癌細(xì)胞中的FOXO3a定位出現(xiàn)異常，癌細(xì)胞胞質(zhì)中的FOXO3a處于去活化狀態(tài)，失去對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用[9-10]，F(xiàn)OXO3a的異常表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生、進(jìn)展有相關(guān)性。

對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的基因譜分析顯示，F(xiàn)OXO3a是血管內(nèi)皮細(xì)胞中重要的轉(zhuǎn)錄因子，F(xiàn)OXO3a的活性下降可促進(jìn)血管過度生成[13]。有研究表明，F(xiàn)OXO3a過表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌組織中的微血管密度呈負(fù)相關(guān)[14]；FOXO3a與乳腺癌組織中血管生成的關(guān)系在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中尚未見報(bào)道。本研究中，癌旁組織的FOXO3a主要表達(dá)細(xì)胞核中，可以發(fā)揮其抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的正常功能，從而抑制新生血管的形成；而在乳腺癌組織，F(xiàn)OXO3a在細(xì)胞核表達(dá)陽(yáng)性者的微血管密度值低于胞核陰性者，胞質(zhì)陽(yáng)性者癌組織微血管密度值與胞質(zhì)陰性者比較無(wú)差異。提示癌細(xì)胞中FOXO3a定位異常（從胞核轉(zhuǎn)位于胞質(zhì)），其正?；钚允芤种?，不能發(fā)揮其限制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的能力[13]，間接促進(jìn)新生血管的過度生成。

腫瘤的生長(zhǎng)依賴新生血管的形成，而血管的形成與血管內(nèi)皮的增殖密切相關(guān)。本研究表明，處于活性狀態(tài)的FOXO3a可負(fù)性調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞因子的增殖。因此，通過調(diào)控FOXO3a的活性，促進(jìn)FOXO3a活化而發(fā)揮其抑制血管形成的作用，有望為腫瘤治療提供新的思路。

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