陳紅波 項曉駿 范軍芬 郭小文 壽旗揚 馬紅珍 范永升

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種自身免疫介導(dǎo)引起多臟器損傷的彌漫性結(jié)締組織病，需要長期用藥治療。但長期應(yīng)用激素類和免疫抑制劑類藥物會引發(fā)嚴(yán)重的不良反應(yīng)[1]。青蒿素作為祖國傳統(tǒng)醫(yī)藥的代表在治療瘧疾上取得了令人矚目的成績，近年來研究發(fā)現(xiàn)青蒿素類衍生物在SLE的治療上也有一定作用[2]。青蒿素類衍生物SM934可以減少SLE小鼠自身抗核抗體產(chǎn)生，減輕小鼠腎損傷，延長SLE小鼠生命[3]。DNA甲基化調(diào)控在SLE發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，SLE患者CD4+T細(xì)胞基因組DNA普遍存在低甲基化，這種低甲基化狀態(tài)可誘導(dǎo)SLE發(fā)病或加重[4-5]?；诖?，本研究旨在探討青蒿素類衍生物雙氫青蒿素是否通過影響MRL/lpr SLE小鼠CD4+T細(xì)胞DNA甲基化水平，從而發(fā)揮其治療作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 6周齡SPF級雌性MRL/lpr SLE小鼠5只，體重（31.6±1.9）g，由上海萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供。RPMI1640培養(yǎng)液（美國Gibco公司）、FBS（美國Hyclone公司）、雙氫青蒿素（純度98%）（上海伊卡生物技術(shù)有限公司）、CD4（L3T4）-MicroBeads Kit（德國 MiltenyiBiotec公司）、Anti-mouse CD3-FITC（美國Abcam公司）、Anti-mouse CD4-PE（美國 Abcam公司）、Cell Counting Kit-8（CCK-8）（七海生物公司）、TIANamp Genomic DNA Kit（美國TIANGEN公司）、流式細(xì)胞儀（美國BD公司）、倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）、高效液相色譜儀LC-10ATvp（日本島津公司）。

1.2 方法

1.2.1 磁珠抗體分選CD4+T細(xì)胞 處死MRL/Lpr SLE小鼠后，無菌條件下取出脾臟，制備脾臟單核細(xì)胞懸液（107個/ml）。取1×107個細(xì)胞用PBS重懸細(xì)胞，按照免疫磁珠分選柱說明書操作分離CD4+T細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測CD4+T細(xì)胞純度。

1.2.2 細(xì)胞原代培養(yǎng)、傳代、分組及藥物干預(yù) 從小鼠脾臟分離出來的CD4+T原代細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)傳代（37℃、RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液、5%二氧化碳培養(yǎng)箱），傳至第3代后進(jìn)行藥物干預(yù)。

1.2.3 CCK-8檢測雙氫青蒿素細(xì)胞毒性 將稀釋后的CD4+T細(xì)胞加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入1×104個細(xì)胞，每孔依次加入不同劑量的雙氫青蒿素，使其終濃度為 0、10、20、40、60、80、100μmol/L（分別為對照組，10、20、40、60、80、100μmol/L 組），設(shè)置 3 個重復(fù)孔及空白對照（不加細(xì)胞）；37℃，5%二氧化碳飽和濕度培養(yǎng)48h，加入 20μmol/L CCK-8，避光孵育 1h；酶標(biāo)儀測定每孔450nm波長吸光度，計算半抑制濃度（IC50）和雙氫青蒿素的細(xì)胞毒性。

1.2.4 高效液相色譜檢測基因組DNA甲基化水平

1.2.4.1 基因組DNA提取和水解：按照DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA，然后將1μg DNA樣品溶于3μl去離子水中，高溫變性后冰浴，加入1μl 0.1mol/L醋酸銨（pH5.3）、1μl核酸酶 P1（2U/μl）、1μl 1mol/L 碳酸氫銨（pH5.3）和 1μl磷酸二酯酶（0.002U/μl），在 37℃下反應(yīng)2h后加入1μl堿性磷酸酶（0.5U/μl），繼續(xù)反應(yīng)1h。水解完全的DNA樣品凍存在-20℃待分析。

1.2.4.2 高效液相色譜檢測基因組DNA甲基化水平采用島津液相色譜系統(tǒng)（LC-10AT vp），根據(jù)5種堿基的性質(zhì)和分離效果，得到最佳色譜條件如下：色譜柱，phenomenex C18 柱 （4.6～250mm，5μm）；流動相，0.01mol/L磷酸二氫鉀：甲醇（體積比15：85）；柱溫，25℃；流速，1.2ml/min；檢測波長，260nm；進(jìn)樣量，20μl。腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為1、5、10、50、100μmol/L，5- 甲 基 胞 嘧 啶 為 0.05、0.25、0.50、2.50、5.00μmol/L，用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 熒光定量PCR檢測DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）、生長阻滯和 DNA 損傷基因 a（Gadd45a）mRNA表達(dá)水平（1）RNA抽提：利用Trizol抽提MRL/lpr SLE小鼠CD4+T細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計測定濃度。（2）逆轉(zhuǎn)錄：反應(yīng)體系為（20.0μl）：total RNA（5μl）,Random Primer p（dN）6（0.2μg/μl，1μl），Rnase-free ddH2O（5μl），5×Reaction Buffer（4.0μl）,dNTP Mix（10mmol/L，2.0μl），Rnase inhibitor（20U/μl，1.0μl），AMV Reverse Transcriptase（10U/μl，2.0μl）。（3）PCR 擴(kuò)增：引物如下：反應(yīng)體系（20μl）：ddH2O（7μl），2×SYBR Premix Ex TaqTM（10μl），引物 F（10μmol/L，1.0μl），引物 R（10μmol/L，1.0μl），模板 cDNA（1.0μl）。反應(yīng)條件：95℃（3min）；40 個循環(huán)（95℃，15sec）；60℃，40sec（收集熒光）。完成上述步驟后，把加好樣品的96孔板放在熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。

1.2.6 Western blot檢測DNMT1和Gadd45a蛋白表達(dá)水平 將蛋白樣品加入4×SDS緩沖液中，沸水煮沸后12 000g離心1min；取一定量總蛋白加入SDS-PAGE凝膠上樣孔內(nèi)，垂直電泳槽跑膠電泳后，將PVDF膜在甲醇中浸泡，轉(zhuǎn)移電泳槽轉(zhuǎn)膜后，將PVDF膜至于Blocking Buffer中，加入一抗，4℃孵育過夜，洗滌后加入二抗，室溫孵育2h，洗滌將PVDF膜平放在顯色板上，ECL底物滴加在膜表面，化學(xué)發(fā)光儀收集信號。

1.3 觀察指標(biāo) （1）比較不同濃度雙氫青蒿素對CD4+T細(xì)胞的毒性；（2）比較不同雙氫青蒿素濃度組CD4+T細(xì)胞基因組DNA甲基化水平；（3）比較不同雙氫青蒿素濃度組CD4+T細(xì)胞DNMT1和Gadd45a mRNA表達(dá)水平；（4）比較不同雙氫青蒿素濃度組CD4+T細(xì)胞DNMT1和Gadd45a蛋白表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件；計量資料以表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分選后CD4+T細(xì)胞的純度 應(yīng)用免疫磁珠法分選CD4+T細(xì)胞，結(jié)果顯示純度達(dá)到89.96%，分選后的CD4+T細(xì)胞狀態(tài)良好，滿足后續(xù)實驗需求。

2.2 不同濃度雙氫青蒿素對CD4+T細(xì)胞的毒性比較對照組，10、20、40、60、80、100μmol/L 組 CD4+T 細(xì)胞450nm 波長吸光度分別為 0.935±0.022、0.846±0.012、0.677±0.012、0.627±0.019、0.486±0.014、0.351±0.017、0.262±0.013，10、20、40、60、80、100μmol/L 組 CD4+T 細(xì)胞抑制率分別為 10.07%、29.12%、34.72%、50.66%、65.88%、75.91%。雙氫青蒿素對SLE小鼠CD4+T的IC50為62μmol/L。雙氫青蒿素可抑制CD4+T細(xì)胞增殖，且在實驗范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，對CD4+T細(xì)胞增殖的抑制作用增強(qiáng)。

2.3 不同雙氫青蒿素濃度組CD4+T細(xì)胞基因組DNA甲基化水平比較 對照組與40、60、80μmol/L組CD4+T細(xì)胞基因組DNA甲基化水平分別為（3.114±0.122）%、（3.375±0.071）%、（3.540±0.076）%、（3.639±0.104）%，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），組間兩兩比較差異亦均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。即雙氫青蒿素處理后，CD4+T細(xì)胞基因組DNA甲基化水平顯著升高；且雙氫青蒿素濃度越高，基因組DNA甲基化水平越高。

2.4 不同雙氫青蒿素濃度組CD4+T細(xì)胞DNMT1和Gadd45a mRNA表達(dá)水平比較 見表1。

表1 不同雙氫青蒿素濃度組CD4+T細(xì)胞DNMT1和Gadd45a mRNA表達(dá)水平比較

由表1可見，不同雙氫青蒿素濃度組CD4+T細(xì)胞DNMT1和Gadd45a mRNA表達(dá)水平比較均有統(tǒng)計學(xué)差異（均P＜0.05），組間兩兩比較差異亦均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。即雙氫青蒿素處理后，CD4+T細(xì)胞DNMT1 mRNA表達(dá)上調(diào)，而Gadd45a mRNA表達(dá)下調(diào)；且雙氫青蒿素濃度越高，DNMT1 mRNA表達(dá)水平越高，Gadd45a mRNA表達(dá)水平越低。

2.5 不同雙氫青蒿素濃度組CD4+T細(xì)胞DNMT1和Gadd45a蛋白表達(dá)水平比較 見圖1、表2。

圖1 不同雙氫青蒿素濃度組CD4+T細(xì)胞DNMT1和Gadd45a蛋白表達(dá)電泳圖（a：對照組；b：40μmol/L 組；c：60μmol/L 組；d：80μmol/L 組）

表2 不同雙氫青蒿素濃度組CD4+T細(xì)胞DNMT1和Gadd45a蛋白表達(dá)水平比較

由圖1、表2可見，不同雙氫青蒿素濃度組CD4+T細(xì)胞DNMT1和Gadd45a蛋白表達(dá)水平比較均有統(tǒng)計學(xué)差異（均P＜0.05），組間兩兩比較差異亦均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。即雙氫青蒿素處理后，CD4+T細(xì)胞DNMT1蛋白表達(dá)上調(diào)，而Gadd45a蛋白表達(dá)下調(diào)；且雙氫青蒿素濃度越高，DNMT1蛋白表達(dá)水平越高，Gadd45a蛋白表達(dá)水平越低。

3 討論

SLE是一種機(jī)體免疫功能異常導(dǎo)致多系統(tǒng)受損的慢性自身免疫性疾病[6]。SLE患者CD4+T細(xì)胞基因組DNA普遍存在低甲基化，這與SLE患者體內(nèi)甲基化調(diào)節(jié)基因表達(dá)異常有關(guān)[4-5]。DNMT1是DNA甲基化轉(zhuǎn)化過程中最關(guān)鍵的限速酶，維持基因組DNA甲基化水平，其酶活性與濃度與甲基化水平呈正相關(guān)。在SLE患者中，DNMT1濃度及酶活性明顯下降，導(dǎo)致基因組DNA呈低甲基化[7]。Gadd45a是一種重要的DNA甲基化抑制蛋白，它通過促進(jìn)DNA修復(fù)，去除DNA甲基化標(biāo)記，誘導(dǎo)甲基化敏感基因表達(dá)。Gadd45a基因在SLE患者CD4+T細(xì)胞中高表達(dá)，與SLE病情嚴(yán)重程度呈顯著正相關(guān)[8-9]。

屠呦呦課題組發(fā)現(xiàn)雙氫青蒿素治療SLE療效肯定，且無明顯毒副反應(yīng)[10]。Huang等[11]發(fā)現(xiàn)雙氫青蒿素可能是通過抑制TLR4/IRF/IFN信號通路，從而抑制LPS誘導(dǎo)的脾細(xì)胞活化，顯著減少LPS誘導(dǎo)的脾細(xì)胞中IFN-α和IFN-β的產(chǎn)生，起到對MRL/lpr狼瘡鼠的治療作用。徐麗敏等[12]發(fā)現(xiàn)雙氫青蒿素通過阻止B細(xì)胞增殖，促進(jìn)CD8+T細(xì)胞增殖，從而直接和間接抑制B細(xì)胞活性，減少自身免疫抗體產(chǎn)生，達(dá)到治療SLE的作用。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素通過上調(diào)DNMT1表達(dá)和下調(diào)Gadd45a表達(dá)，升高SLE小鼠CD4+T細(xì)胞基因組DNA甲基化水平，從而減少自身免疫抗體產(chǎn)生，進(jìn)而達(dá)到治療SLE的作用。本研究主要是在體外細(xì)胞實驗中證實了雙氫青蒿素對SLE小鼠的治療作用，在小鼠體內(nèi)探討其生物學(xué)作用將是進(jìn)一步研究的方向。

[1]中華醫(yī)學(xué)會風(fēng)濕病學(xué)分會.系統(tǒng)性紅斑狼瘡診斷及治療指南[J].中華風(fēng)濕病雜志,2010,14(5):342-346.

[2]楊嵐,張東.雙氫青蒿素及其紅斑狼瘡新適應(yīng)癥研究概述[J].科學(xué)通報,2017,62(18):2007-2012.

[3]Hou LF,He SJ,Li X,et al.Oral administration of artemisinin analog SM934 ameliorates lupus syndromes in MRL/lpr,mice by inhibiting Th1and Th17cell responses[J].Arth Rheum,2011,63(8):2445-2455.

[4]Dipak RP,Bruce CR.Epigenetic mechanisms in lupus[J].Current Opinion in Rheumatology,2010,22(5):478-482.

[5]Javierre BM,Fernandez AF,Richter J.Changes in the pattern of DNA methylation associate with twin discordance in systemic lupus erythematosus[J].Genome Res,2010,20(2):170-179.

[6]Tsokos GC.Systemic lupus erythematosus[J].N Engl J Med,2011,365(22):2110-2121.

[7]Balada E,Ordi-Ros J,Serrano-Acedo S,et al.Transcript levels of DNA methyltransferases DNMT1,DNMT3A and DNMT3B in CD4+T cells from patients with systemic lupus erythematosus[J].Immunology,2008,124(3):339-347.

[8]Barreto G,Schfer A,Mar=hold J,et al.Gadd45a promotes epigenetic gene activation by repair-mediated DNA demethylation [J].Nature,2007,445(7128):671-675.

[9]Yaping Li,Ming Zhao,Heng Yin,et al.Qianjin Lu.Overexpression of the Growth Arrest and DNA Damage-Induced 45a Gene Contributes to Autoimmunity by Promoting DNA Demethylation in Lupus T Cells[J].Arthritis Rheum,2010,22(5):1438-1447.

[10]屠呦呦,楊嵐.治療紅斑狼瘡和光敏性疾病的含雙氫青蒿素的藥物組合物[P].中華人民共和國專利:99103346.9,2003-07-30.

[11]Huang X,Xie Z,Liu F,et al.Dihydroartemisinin inhibits activation of the Toll-like receptor 4 signaling pathway and production of type I interferon in spleen cells from lupus-prone MRL/lpr mice[J].Int Immunopharmacol,2014,22(1):266-272.

[12]徐麗敏,陳學(xué)榮,屠呦呦.雙氫雙氫青蒿素對狼瘡性BXSB小鼠的作用[J].中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志,2002,1(1):19-20.