蔡麗希, 陳小萍, 劉黎星

(莆田學院 基礎(chǔ)醫(yī)學部，莆田 351110)

多環(huán)芳烴(PAHS)是一類廣泛存在于環(huán)境中的具有致畸、致癌、致誘變的典型有機污染物[1]，尤其是像4環(huán)芘一樣的高分子量多環(huán)芳烴很難被氧化降解，對生態(tài)環(huán)境和人類健康造成極大的威脅[2-3]。目前微生物修復被認為是治理PAHS污染的最具潛力的修復方法[4]。但是研究工作已經(jīng)從單一篩選能夠降解PAHS的微生物轉(zhuǎn)變?yōu)榛蛘{(diào)控機制、代謝途徑和高效工程菌的研究[5-6]。本實驗采用富集培養(yǎng)的方法從海洋紅樹林表層沉積物中篩選出多環(huán)芳烴芘的降解菌群，提取其質(zhì)粒并導入至大腸桿菌DH5α中，馴化篩選出降解芘的高效基因工程菌群[7]，并進一步探討了該菌群和質(zhì)粒的降解機制，進而為芘的微生物修復提供重要的科學依據(jù)[8]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

土樣采樣于海洋紅樹林區(qū)的表層沉積物。

芘購置于Sigma-Aldrich 公司；二氯甲烷、甲醇(色譜純)購置于江蘇漢邦科技有限公司。

海洋細菌培養(yǎng)基：磷酸高鐵0.01 g；酵母浸膏1 g；蛋白胨5 g，加陳海水定容至1 L，pH 7.6～7.8。

無機培養(yǎng)基(MSM，mg/L)： MgSO4·H2O(200)； Na2HPO4(800)；(NH4)2SO4(1000)；CaCl2·2H2O(100)；(NH4)6M0O24·4H2O(1)；FeCl3·6H2O(5)；KH2PO4(200)；pH值為7.2，121℃，滅菌15 min。

芘母液：芘溶解于丙酮并定容為濃度5 mg/mL的母液，經(jīng)0.22 μm尼龍膜過濾后封口避光保存。

PYR-MSM培養(yǎng)基：依據(jù)不同的芘終濃度(50～500 mg/L)，移取一定體積的芘母液到無菌的無機培養(yǎng)基中，過夜待丙酮揮發(fā)后使用。

1 .2 實驗方法

1.2.1 環(huán)境樣品的富集培養(yǎng)

分別稱取10 g新鮮紅樹林表層沉積物樣品和8 g無菌小玻璃珠，置于盛有90 mL無菌水的錐形瓶中，25℃，150 r/min恒溫震蕩3 h[9]。靜置30 min后，移取5 mL上清液至45 mL新配置的以芘為唯一C源與能源的PYR-MSM培養(yǎng)基中(芘終濃度為100 mg/L)。25℃，150 r/min，繼續(xù)避光振蕩培養(yǎng)，每3 d觀察錐形瓶中培養(yǎng)液的顏色和濁度的變化。一個月后，轉(zhuǎn)接5 mL的上層培養(yǎng)液到新配制的45 mL PYR-MSM培養(yǎng)基中(200mg/L)，富集馴化培養(yǎng)一個月，再梯度增加芘濃度重復以上步驟；如此共富集馴化培養(yǎng)5個月，獲得能夠?qū)?00 mg/L芘作為唯一C源與能源的降解菌群[10-11]。

1.2.2 質(zhì)粒的提取

選用本實驗室的改良方法：移取1.5 mL芘降解菌群 YL液體培養(yǎng)菌液至已滅菌的離心管中，在4℃下12 000 r/min離心30 s，棄上清(盡可能吸干培養(yǎng)液)。加入TAE渦漩振蕩洗滌菌體，4℃下10 000 r/min離心收集菌體沉淀，加入100 μL TAE充分混勻菌體，室溫靜置5 min；加入300 μL冰預冷的 SolutionⅠ(50 mmol/L Tris-Hcl，3(SDS，PH 值為12.61)，混勻，65℃水浴8-12 min至液體清亮；加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)混合液，輕柔顛倒混勻；4℃下12 000 r/min離心10 min；吸取上清液至5 mL離心管中，加入兩倍體積冰預冷的無水乙醇，4℃下靜置30 min，12 000 r/min，離心10 min，棄上清，倒扣離心管在吸水紙上，吸干液體。1 mL 70%乙醇洗滌1次，4℃下12 000 r/min，離心1 min，棄上清液，將離心管平放、開蓋置于37℃烘箱中干燥。加入20 μL無菌去離子水-20℃保存[10-11]。

1.2.3 感受態(tài)細胞制備和轉(zhuǎn)化

移取30 μLE.coliDH5α菌液，接種于3 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min恒溫培養(yǎng)3 h；將上述培養(yǎng)液平均分裝至2支離心管中，于4℃下4000 r/min離心10 min收集菌體，棄上清液；振蕩使菌體懸浮于1 mL冰預冷的100 mmol/L CaCl2溶液，以臺式高速離心機最大轉(zhuǎn)度離心30 s，棄上清，每管加入100 μL冰預冷的0.1 mol/L CaCl2溶液并輕緩懸浮細胞，4℃冰箱放置16 h后使用效果最好，可保存一周。移取2 μL本實驗室改良方法提取的質(zhì)粒反應(yīng)液于50 μL感受態(tài)細胞中，輕柔轉(zhuǎn)動混勻并冰浴30 min后，放入42℃水浴中熱擊90 s，立即放冰上2min。每管加入450 μL SOC培養(yǎng)基，37℃復蘇60 min。

1.2.4 降解芘質(zhì)粒的篩選與鑒定

移取30 μL質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌液，接種于芘濃度為0.1 mg/L的PAHs-LB培養(yǎng)基中，37℃，150 r/min避光培養(yǎng)過夜。取2 mL質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌液至18 mL PAHs-MSM培養(yǎng)基(芘濃度為50 mg/L)中，25℃，150 r/min，避光培養(yǎng)，定期觀察三角瓶中培養(yǎng)液的顏色和濁度的變化。一個月后，轉(zhuǎn)接2 mL的上層液至新配制的18 mL PYR-MSM培養(yǎng)基中(芘終濃度為100 mg/L)，避光富集馴化一個月，再梯度增加芘濃度重復以上步驟；如此富集馴化培養(yǎng)共進行5個月，獲得能夠以芘為唯一C源與能源的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌群。

分別移取原大腸桿菌E.coliDH5α及經(jīng)誘導含降解芘基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌，接種至PAHs-MSM培養(yǎng)基中(50 mg/L)，25℃，150 r/min避光培養(yǎng)，每3 d取樣1次。

1.2.5 芘降解菌群YL和質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌對芘降解效果的測定

移取芘降解菌群YL和質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌液至海洋細菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)50 h，離心收集菌體，振蕩使菌體懸浮于MSM培養(yǎng)液，離心，再重懸去除海洋細菌培養(yǎng)基中的碳源，移取相同體積的菌液至新配制的20 mL PYR-MSM培養(yǎng)基(50 mg/L)中，25℃，150 r/min振蕩避光培養(yǎng)。每3 d取1次樣，共取樣7次。21 d后，在培養(yǎng)液中以鹽酸調(diào)pH值為2并加入二氯甲烷，40°C以下超聲萃取振蕩30 min。后用分液漏斗萃取2次并定容。取2 mL樣品用0.22 μm尼龍膜過濾后，于Agilent高效液相色譜儀檢測。設(shè)未加菌的PYR-MSM (50 mg/L)為空白對照。進樣量20 μL，流量1 mL/min，流動相為甲醇/Mllli-Q水(90∶10)，柱溫30℃，檢測波長為239 nm。 Agilent化學工作站進行數(shù)據(jù)處理及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 從紅樹林沉積物中富集分離芘降解菌群

細菌在降解多環(huán)芳烴過程中會釋放某種或某些中間產(chǎn)物，使培養(yǎng)液的顏色發(fā)生一定的變化[12]。Grifoll等發(fā)現(xiàn)多環(huán)芳烴在降解去除過程中會產(chǎn)生一些橙黃色物質(zhì)，培養(yǎng)液的顏色隨即發(fā)生變化，同時水相由澄清變渾濁，表明存在以 PAHs為碳源的降解菌株[13]。在我們的研究中，環(huán)境樣品加入唯一碳源和能源——芘進行富集培養(yǎng)，經(jīng)過1個月的馴化培養(yǎng)后，培養(yǎng)液顏色由乳白色(無機培養(yǎng)基加入一定濃度芘后會由無色透明轉(zhuǎn)變?yōu)槿榘咨?→白色混濁→淡黃色有絲狀條帶→穩(wěn)定不變；在隨后4個月的富集馴化過程中，均可看到上述顏色變化且變化所需時間間隔逐漸縮短。表明隨著PAHs接觸時間的延長，微生物生長的延滯期逐漸縮短，培養(yǎng)液中的微生物及其酶體系已適應(yīng)高濃度芘存在的環(huán)境且降解能力在增強，其混合微生物可以利用芘作為生長基質(zhì)繁殖生長。

2.2 芘降解菌群YL對多環(huán)芳烴的降解

圖1 芘降解菌群YL對多環(huán)芳烴芘的降解曲線Fig 1 The degradation curve of pyrene by YL

芘降解菌群YL在21 d內(nèi)對芘的降解率如圖1所示。在0～6 d內(nèi)，芘降解率處于較低的水平，推測菌群剛投放至高濃度芘的環(huán)境時，受到芘的脅迫與毒害，菌體利用外源底物需用一定的時間，因而顯示出較低的降解率。從第7天開始，芘降解的幅度增大，可能是因為菌群已適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境并利用其中某種細菌的降解中間產(chǎn)物作為營養(yǎng)物質(zhì)，同時已被馴化利用芘作為碳源與能源。從第15天開始，芘降解出現(xiàn)停滯期，其后雖然繼續(xù)降解，但速率相當緩慢。原因可能是隨著培養(yǎng)基中的芘數(shù)量減少，使C源不足，降解過程中產(chǎn)生的某些中間代謝產(chǎn)物抑制細菌對芘的進一步利用，這有待于進一步的研究考證。在培養(yǎng)的第21天，測定培養(yǎng)液中剩余的芘濃度為3.95 mg/L，相應(yīng)的降解率92.09%；空白對照瓶中芘的回收率達到92.9%以上，表明非生物因子對芘降解的影響很小，可視為對照樣無變化。說明芘降解菌群YL中存在著能很好地利用芘作為底物的微生物。

2.3 轉(zhuǎn)化菌的芘降解能力

2.3.1 降解芘質(zhì)粒的篩選與鑒定

PAHs在降解過程中會產(chǎn)生某種或某些中間產(chǎn)物，使培養(yǎng)液的顏色發(fā)生變化。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌在富集培養(yǎng)的前2個月未像芘降解菌群YL發(fā)生顏色變化，第3個月后，顏色由乳白色→白色混濁→粉紅色伴有絲狀沉淀→穩(wěn)定不變，表明帶有降解基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌需要一定時間適應(yīng)環(huán)境并誘導產(chǎn)生相應(yīng)的酶后，才可以利用芘作為唯一碳源和能源生長。

在芘含量為50 mg/L的無機培養(yǎng)基中加入原大腸桿菌E.coliDH5α及馴化得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌，兩者對芘的降解率的結(jié)果如表1所示，培養(yǎng)21 d后，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌培養(yǎng)液中芘含量由50 mg/L下降到7.155 mg/L，相應(yīng)降解率為85.69%，而對照物受體菌E.coliDH5α的芘去除率僅為2.01%。由此表明質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌具有不俗的芘降解能力，攜帶芘降解基因的重組質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)化進E.coliDH5α，并穩(wěn)定地發(fā)揮降解作用。

表1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌與大腸桿菌DH5α芘降解率的對比Table 1 The comparison of the degradation rate of pyrene by DH5α and the transformed bacteria

2.3.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌對芘的降解

圖2 轉(zhuǎn)化菌對芘的降解曲線Fig 2 The degradation curve of pyrene by the transformed bacteria

相比于降解菌群YL降解芘的情況，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌的降解趨勢不一樣，在剛投放時，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌的適應(yīng)期縮短了近一半，而且即使是在適應(yīng)期也具有一定的降解作用；在第3～6天，降解幅度最大；在培養(yǎng)的第6天，測定培養(yǎng)液中剩余芘的濃度為29.40 mg/L，相應(yīng)的降解率為41.2%；7～18 d，芘的降解幅度逐漸減小并在18～21 d時趨于平緩。原因可能是隨著芘的消耗，過低濃度的芘不利于與質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌的充分接觸，使得可利用的碳源與能源減少，受芘誘導產(chǎn)生的酶量也相應(yīng)減少，芘降解受到一定的抵制，這有待于進一步研究考證。最后第21天，測定培養(yǎng)液中剩余的芘的濃度為7.155 mg/L，相應(yīng)的降解率為85.69%；而未加菌液的對照瓶中芘的回收率達到90%以上，非生物因子對多環(huán)芳烴芘的降解影響很小，仍可視為對照樣無變化。說明質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌能夠利用芘作為唯一的碳源與能源并繁殖生長。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌具有不俗的降解芘的能力，其重組質(zhì)粒上攜帶降解芘的基因。

3 結(jié)論

目前研究表明，負責PAHS降解的基因簇有的位于染色體上[14]，有的位于質(zhì)粒上[15-16]，能夠降解多環(huán)芳烴的代謝酶通常是由細菌的質(zhì)粒基因編碼的[17]。本課題通過比較受體菌大腸桿菌與質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌的芘降解率,表明與多環(huán)芳烴降解有關(guān)的基因位于芘降解菌群的內(nèi)生質(zhì)粒上，并且通過導入質(zhì)粒的方法成功地創(chuàng)造出具有不俗降解能力的新菌株。為利用重組工程菌進行多環(huán)芳烴的生物修復奠定理論基礎(chǔ)與實驗基礎(chǔ)[18-19]。

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