李秀菊，袁 夢，黃嘉麗，李若齊，顏亨梅，汪 波

(北京師范大學(xué)珠海分校 工程技術(shù)學(xué)院，珠海 519085)

硝酸鹽和亞硝酸鹽攝入過多會對人體造成危害[1]，具有強氧化性的亞硝酸鹽能使正常的亞鐵血紅蛋白轉(zhuǎn)變成高鐵血紅蛋白而失去運氧功能[2]。當(dāng)人體血液有20%的亞鐵血紅蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)楦哞F血紅蛋白時就會造成缺氧癥狀，臨床表現(xiàn)為皮膚黏膜青紫，頭暈、嘔吐、全身無力，嚴重者會因呼吸衰竭而死[3]。亞硝酰胺中甲基以及亞硝基脲可以使大鼠、小鼠等實驗動物子代產(chǎn)生先天畸形，特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)畸形[4]。因此，合理有效地控制體內(nèi)的亞硝酸鹽及亞硝胺具有重大意義?，F(xiàn)今藥物的研究主要以陸生植物為主，且其中大部分為名貴中藥，這并不利于藥物的開發(fā)應(yīng)用。于是，人們把目光投向有著巨大發(fā)掘和利用空間的海洋，逐漸關(guān)注到馬尾藻這種種植周期短，投入成本低的溫暖性海藻[5]。在中國大多數(shù)沿海地帶有馬尾藻生長，并能夠?qū)嵭写笠?guī)模養(yǎng)殖，所以馬尾藻作為原材料來源豐富[6]。

姚勇和孟慶勇對輻射損傷型小鼠服用馬尾藻提取劑后，發(fā)現(xiàn)馬尾藻提取劑所制備的口服液具有優(yōu)良的抗輻射效果，并且作用效果與馬尾藻提取劑的用量呈正相關(guān)；由此可見，馬尾藻具有良好的抗輻射能力[7]。海藻多糖在實驗中已驗證能提高哺乳動物非特異性免疫和特異性免疫,能大幅度地增強小鼠的細胞免疫和體液免疫能力及其腹腔巨噬細胞的吞噬能力[8]。肖為等利用乙醇進行全緣馬尾藻的粗提取，并測定了全緣馬尾藻提取物的抗氧化活性及對亞硝化反應(yīng)的抑制作用，其結(jié)果表明，全緣馬尾藻醇提取物具有一定的抗氧化能力，且其對清除體內(nèi)亞硝酸鹽與阻斷亞硝胺合成有一定效用[9]。

楊亞云對藻泥和藻粉的研究表明，藻泥和藻粉具有一定的保濕性，以藻多糖作為基本原料制成的護膚霜能增加皮膚的膠原蛋白含量和皮膚的彈性值[10]。這表明馬尾藻具有綜合開發(fā)利用的廣闊前景，如開拓它的美容護膚品市場，提高其附加經(jīng)濟價值。

多數(shù)海藻的提取物質(zhì)具有抗氧化和抗腫瘤的功效，但是關(guān)于馬尾藻提取物清除亞硝酸鹽以及阻斷亞硝胺合成的報道并不多見[9]。在驗證本實驗所用的馬尾藻是一種安全無污染原材料的基礎(chǔ)上，測定了馬尾藻對亞硝胺合成的阻斷率以及對亞硝酸鹽的清除率，從而對馬尾藻粗提物抑制亞硝化作用的能力進行研究分析，為馬尾藻的進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

海藻來源：中國珠海東澳島馬尾藻(Hizikiafusiformis)。

主要材料前處理：購得的新鮮馬尾藻去除雜質(zhì)洗凈，再用蒸餾水沖洗2次，放入80℃烘干機烘干至恒重后，剪碎。馬尾藻粉末過篩后儲存于干燥的玻璃瓶備用[11]。

采用固-液浸提法。稱取5份重量分別為10 g的干燥馬尾藻樣品，分別用140 mL不同濃度(0%、25%、50%、75%和100%)的乙醇置于4℃冰箱浸提3 d。真空抽濾得到不同濃度的醇提液。

1.2 實驗方法

農(nóng)藥殘留和重金屬殘留的測定：砷詳細步驟見GB/T5009.11—2003[12]；鉛詳見GB5009.12—2010[13]；有機磷或氨基甲酸脂類農(nóng)藥詳見GB/T20769—2008[14]。

馬尾藻提取物對亞硝胺合成阻斷率的測定采用α-萘胺法[15]；馬尾藻對亞硝酸鹽清除率采用鹽酸萘乙二胺比色法[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 重金屬和農(nóng)藥殘留檢測結(jié)果

根據(jù)表1可知鋁的含量為76.7 mg/kg，遠遠低于DB53/T288—2009中的要求，故馬尾藻中鋁的含量在安全范圍內(nèi)。砷、銅、鎘的含量均在國標或者地標要求的安全范圍內(nèi)。根據(jù)表2可知，馬尾藻的各項農(nóng)藥殘留均未檢出；由此可知，本實驗所用的馬尾藻是一種安全、無農(nóng)藥殘留的原材料。

表1馬尾藻重金屬殘留檢測結(jié)果(mg/kg)Table 1 Detection results of heavy metal residue in Hizikia fusiformis

表2馬尾藻農(nóng)藥殘留檢驗結(jié)果Table 2 Test results of pesticide residues in Hizikia fusiformis

2.2 馬尾藻對亞硝胺合成阻斷結(jié)果

根據(jù)圖1可知，馬尾藻具有很強的阻斷亞硝胺合成的能力，最高可達100%。當(dāng)提取的乙醇濃度在0%～50%之間時，馬尾藻阻斷亞硝胺合成的能力隨著乙醇濃度的提高而升高。乙醇濃度在50%～75%之間時，清除效果最佳，清除率高達100%。之后隨著乙醇濃度的提高，馬尾藻阻斷亞硝胺合成的能力反而降低。

圖1 不同濃度乙醇提取液對亞硝胺合成的阻斷率Fig 1 Nitrosamine synthesis blocking rate of H.fusiformis extract with different ethanol concentrations

2.3 馬尾藻對亞硝酸鹽的清除率

由圖2可知，馬尾藻提取物有較強的清除亞硝酸鹽的能力。提取馬尾藻的乙醇濃度在0%～75%之間時，馬尾藻提取物對亞硝酸鹽的清除率與乙醇濃度呈正相關(guān)，在乙醇濃度為75%時，馬尾藻提取物對亞硝酸鹽的清除率最高值達到53.33%。之后馬尾藻對亞硝酸鹽的清除率隨著乙醇濃度的升高而降低。

圖2 不同濃度乙醇提取液對亞硝酸鹽的清除率Fig 2 Nitrite scavenging rate of H.fusiformis extract with different ethanol concentrations

3 討論

檢測結(jié)果表明，馬尾藻中鉛等高危重金屬未檢出，鋁的含量為76.7 mg/kg，遠遠低于DB53/T288—2009的要求；而敵敵畏、氧樂果、甲氰菊酯等農(nóng)藥殘留未檢出；由此表明：實驗所用馬尾藻安全、無農(nóng)藥殘留。

在模擬人體胃液條件下(溫度37℃、pH 3.0)，馬尾藻醇提物可一定程度上阻斷亞硝胺合成，當(dāng)乙醇濃度為0%時，馬尾藻粗提物對亞硝胺的合成阻斷率可達到72.59%；之后阻斷率隨著乙醇濃度的升高而提高，乙醇濃度在50%～75%之間時對亞硝胺合成的阻斷能力最強，清除率達到100%。 當(dāng)乙醇濃度繼續(xù)升高時，馬尾藻粗提物對亞硝胺的合成阻斷率逐漸下降，當(dāng)乙醇濃度為100%時，阻斷率下降到82.94%。肖為等測定在不同乙醇提取比例下全緣馬尾藻的提取物對亞硝胺合成的阻斷能力，得出用75%乙醇提取的醇提物對亞硝胺合成的阻斷能力最強，達到22.78%[9]。分析結(jié)果產(chǎn)生差異的原因可能為原材料采用的馬尾藻亞種不同，不同亞種之間的活性成分的種類和比例存在差異，在提取過程中得到的提取物的成分與比例有差異，從而導(dǎo)致了馬尾藻提取物對亞硝胺的阻斷能力有差異。

同時，馬尾藻提取物有清除亞硝酸鹽的能力。乙醇濃度在0%～75%之間時，亞硝酸鹽的清除率逐漸提高，并且在25%～50%之間清除率顯著提高，當(dāng)醇提液的濃度是75%時，馬尾藻粗提物對亞硝酸鹽的清除效果最佳，清除率達到最高值53.33%。隨后隨著乙醇濃度的增加，亞硝酸鹽的清除率逐漸下降，當(dāng)乙醇濃度為100%時，清除率下降到42.10%。究其原因可能是馬尾藻中的活性成分分為脂溶性和水溶性[17]，可能當(dāng)乙醇濃度為75%時，有機溶劑與水的比例十分契合馬尾藻活性成分的萃取的最佳要求，從而萃取的活性成分含量最高，對亞硝酸鹽的清除效果最佳。

在海藻活性成分的提取方法中，水提法和醇提法具有操作簡單，對設(shè)備要求低，成本低廉的優(yōu)點。本項目采用的提取方法為醇提法，相對于水提法，醇提法提取時間短，方便快捷，但是提取率較低，水提法用時長，但提取效率高，成本低[18]。同時，不同的乙醇濃度會影響活性成分的浸出率，肖為等[9]測定在不同乙醇提取比例下全緣馬尾藻的提取物對亞硝酸鈉的清除能力，得出用0%乙醇提取的醇提物對亞硝酸鈉的清除能力最強，達到12.42%；隨著浸取液中乙醇比例的增加，提取物對亞硝酸鈉的清除能力呈下降趨勢。分析實驗結(jié)果產(chǎn)生差異的可能原因有如下兩條：1)本實驗與肖為等人的實驗采用的原材料——馬尾藻亞種不同，不同亞種之間的活性成分的種類和比例存在差異，最終導(dǎo)致了實驗結(jié)果的不一致。2)肖為等人實驗的樣品液是烘干后再溶解的無醇樣液，本實驗所測定的樣液是含有乙醇的粗提液，可能是由于乙醇的存在影響了粗提物對亞硝酸鈉的清除能力。

本項目當(dāng)醇提液的濃度是75%時，馬尾藻粗提物對亞硝酸鹽的清除效果最佳，當(dāng)乙醇濃度在50%～75%之間時對亞硝胺合成的阻斷能力最強，由此分析乙醇濃度對馬尾藻提取物的浸出率的影響。張郁松探究乙醇濃度對沙棘果渣中總黃酮提取的影響時發(fā)現(xiàn)，提取效果以50%濃度最好，分析原因可能是乙醇濃度過高會溶解一定的脂類物質(zhì)，從而降低了乙醇對黃酮類物質(zhì)的溶解[19]。魏穎等優(yōu)化蘋果渣中多酚的提取工藝，發(fā)現(xiàn)乙醇的體積分數(shù)為60%時提取效果最好[20]。尹麗和郭小慧通過正交試驗對銀杏葉總黃酮的提取工藝進行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)乙醇濃度75%是提取的最佳條件[21]。通過75%乙醇消毒效果最好以及乙醇消毒原理猜想：乙醇具有很大的滲透能力，能進入細胞體內(nèi)，使細胞內(nèi)蛋白凝固，殺死細胞，從而使細胞膜喪失通透性，胞內(nèi)物質(zhì)浸出，而當(dāng)乙醇濃度過高時，乙醇很快使細胞表面的蛋白質(zhì)凝固，從而形成一層蛋白質(zhì)硬膜，這層硬膜對細胞有保護作用，阻止乙醇進一步滲入細胞，胞內(nèi)物質(zhì)浸出率下降。只有當(dāng)乙醇與水以一定比例混合時，乙醇才能有效殺死細胞，改變細胞膜的通透性，達到最高的提取率。

4 結(jié)論

實驗結(jié)果表明：乙醇濃度為50%和75%時，馬尾藻提取物對亞硝胺合成的阻斷率高達100%；乙醇濃度為75%時，馬尾藻提取物清除亞硝酸鹽的能力最好，清除率為53.33%。由此可知，馬尾藻對亞硝化反應(yīng)具有良好的抑制作用。因此，進一步研究馬尾藻醇提物的有效成分和功能，并加以開發(fā)利用，對預(yù)防癌癥有一定的積極意義。

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