許勝杰，孫衛(wèi)國(guó)，陳玉萍，王中魁，陶曉勇，王衛(wèi)

解放軍第三〇九醫(yī)院 a.神經(jīng)內(nèi)科；b.全軍結(jié)核病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，結(jié)核病診療新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；北京 100091

重癥肌無(wú)力（myastheniagravis，MG）是一種自身免疫性疾病，機(jī)制為血清中大量生成的乙酰膽堿受體（acetylcholine receptor，AchR）抗體與AchR結(jié)合，導(dǎo)致AchR生理功能低下，引發(fā)肌肉疲乏無(wú)力癥狀[1]。目前在我國(guó)人群中MG發(fā)病率較高，早發(fā)現(xiàn)及時(shí)治療對(duì)改善預(yù)后具有重要意義。研究表明，血清中AchR抗體滴度與MG的病情密切相關(guān)，通過(guò)檢測(cè)患者血清中AchR抗體水平可以對(duì)MG患者進(jìn)行初步臨床診斷和病情評(píng)估。神經(jīng)肌肉接頭處突觸后膜的AchR是一個(gè)由4種亞基構(gòu)成的五聚體跨膜蛋白，其中α亞基上存在眾多抗原表位，AchR特異性T細(xì)胞及B細(xì)胞表位幾乎均存在于α亞基上，α亞基有望作為抗原用來(lái)檢測(cè)MG患者血清AchR抗體[2]。α亞基是一個(gè)具有4個(gè)跨膜區(qū)域的跨膜蛋白，其胞外域可用于免疫吸附、免疫動(dòng)物制備實(shí)驗(yàn)性重癥肌無(wú)力動(dòng)物模型。我們構(gòu)建了AchR的α亞基胞外氨基酸即第1～221位氨基酸（aa）序列的融合表達(dá)載體pETNusA-AchR-α，原核表達(dá)獲得融合蛋白NusAAchR-α，純化重組蛋白后進(jìn)行血清學(xué)鑒定，對(duì)重組蛋白用于MG患者血清學(xué)診斷的價(jià)值進(jìn)行評(píng)估，探討開(kāi)發(fā)臨床檢測(cè)MG試劑盒的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

臨床陽(yáng)性血清來(lái)自本院神經(jīng)內(nèi)科住院MG患者200例；健康人血清來(lái)自本院體檢中心60例；大腸桿菌BL21（DE3）、質(zhì)粒pET-NusA由本室保存；全基因和引物由華大基因公司合成；限制性內(nèi)切酶HindⅢ和XhoⅠ、T4DNA連接酶購(gòu)自NEB公司；TaqDNA聚合酶和dNTP購(gòu)自天根生化生物公司；HRP酶標(biāo)羊抗人IgG購(gòu)自華美生物技術(shù)公司；瓊脂糖為Spain公司產(chǎn)品；IPTG為Merck公司產(chǎn)品；蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量marker為Sigma公司產(chǎn)品；其他試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

在這個(gè)例句中，根據(jù)句義“the man to help you”可以理解為“the man who helps you”。因此，the man與help構(gòu)成了主謂關(guān)系。

1.2 全基因與引物合成

全合成α亞基胞外氨基酸序列對(duì)應(yīng)的核酸序列（GenBank：M64695），在上、下游 5′和 3′端分別引入HindⅢ酶切位點(diǎn)（AAGCTT）和XhoⅠ酶切位點(diǎn)（CTCGAG），在 3′端引入原核終止密碼子TAA。合成全序列為：

aagcttTCCGAACATGAGACCCGTCTGGTGGCAAAGCTATTTAA AGACTACAGCAGCGTGGTGCGGCCAGTGGAAGACCACCGCCAGG TCGTGGAGGTCACCGTGGGCCTGCAGCTGATACAGCTCATCAAT GTGGATGAAGTAAATCAGATCGTGACAACCAATGTGCGTCTGAA ACAGCAATGGGTGGATTACAACCTAAAATGGAATCCAGATGACT ATGGCGGTGTGAAAAAAATTCACATTCCTTCAGAAAAGATCTGG CGCCCAGACCTTGTTCTCTATAACAATGCAGATGGTGACTTTGC TATTGTCAAGTTCACCAAAGTGCTCCTGCAGTACACTGGCCACA TCACGTGGACACCTCCAGCCATCTTTAAAAGCTACTGTGAGATC ATCGTCACCCACTTTCCCTTTGATGAACAGAACTGCAGCATGAA GCTGGGCACCTGGACCTACGACGGCTCTGTCGTGGCCATCAACC CGGAAAGCGACCAGCCAGACCTGAGCAACTTCATGGAGAGCGCC CCGACACCCCCTACCTGGACATCACCTACCACTTCGTCATGCAG CGCCTGTAActcgag

合成的陽(yáng)性鑒定引物為：

正向 5′-CCCaagcttTCCGAACATGAGACCCGTCT-3′

反向 5′-CCGctcgagTTACAGGCGCTGCATGACGAAGTGG-3′

1.3 pET-NusA-AchR-α重組質(zhì)粒的構(gòu)建

合成的序列及表達(dá)載體pET-NusA分別用HindⅢ和XhoⅠ雙酶切后切膠回收，回收后的產(chǎn)物按濃度比3∶1過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21（DE3），篩選PCR陽(yáng)性菌落進(jìn)行測(cè)序，獲得工程菌pET-NusA-AchR-α。

1.4 NusA-AchR-α融合蛋白的原核表達(dá)

將陽(yáng)性工程菌株轉(zhuǎn)接至含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，于37℃振蕩活化，擴(kuò)大培養(yǎng)中檢測(cè)細(xì)菌菌液D600nm值為0.4時(shí)加入IPTG（終濃度0.3mmol/L），37℃繼續(xù)誘導(dǎo)7h，離心收集菌體，在冰浴狀態(tài)下進(jìn)行超聲波破碎，高速離心（12000r/min，30min），取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.5 NusA-AchR-α融合蛋白的純化

取超聲波破碎后上清，加入咪唑至終濃度為10mmol/L，充分混勻，通過(guò)鎳離子螯合的親和層析柱對(duì)目的蛋白進(jìn)行親和純化，分別以30mmol/L咪唑除去菌體自身蛋白、150mmol/L咪唑洗脫收集目的融合蛋白，通過(guò)12%SDS-PAGE分析純化后目的蛋白的純度。

1.6 NusA-AchR-α融合蛋白的免疫印跡與ELISA分析

取NusA-AchR-α融合蛋白凍干粉末，用PBS緩沖液稀釋成1mg/mL的母液，吸取2μL加入上樣緩沖液煮沸8min，經(jīng)12%SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%的脫脂奶粉封閉后，依次以確診陽(yáng)性MG患者血清、HRP標(biāo)記的羊抗人IgG孵育，漂洗干凈，通過(guò)ECL進(jìn)行暗室自動(dòng)曝光顯影，分析重組蛋白的抗原性。

用碳酸鈉溶液將融合蛋白稀釋至4μg/mL備用，酶標(biāo)板包被過(guò)夜后，37℃封閉2h，用PBST充分洗板5次，確診MG患者血清和健康人血清（1∶200）于37℃孵育1h，重新洗板若干次，每孔中加入用PBS稀釋至1∶1000的HRP標(biāo)記的羊抗人IgG100 μL，37℃振蕩孵育1h，再洗板 5次，加入TMB顯色液反應(yīng)30min顯色，終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)D450nm值，結(jié)果判定以待測(cè)樣本的D450nm值與陰性對(duì)照的D450nm值之比≥210（P/N≥210）為陽(yáng)性，顯示陽(yáng)性結(jié)果的最大抗體稀釋度為血清效價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 pET-NusA-AchR-α表達(dá)載體的構(gòu)建

通過(guò)全基因合成的方法獲得AchRα胞外肽段核酸全序列，克隆到載體pET-NusA中，以合成的引物通過(guò)菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序保存。PCR產(chǎn)物的1%瓊脂糖電泳結(jié)果見(jiàn)圖1，在約660bp處有單一的條帶，和預(yù)期結(jié)果一致。

2.2 NusA-AchR-α融合蛋白的表達(dá)與純化

NusA-AchR-α融合蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量約為80000（圖2），與預(yù)期一致，目的蛋白的表達(dá)量占細(xì)菌總蛋白的25%～35%。SDS-PAGE分析表明重組蛋白主要表達(dá)于上清中，這同理論結(jié)果相同。前期實(shí)驗(yàn)中，我們嘗試將AchRα亞基胞外段用pET-22b載體進(jìn)行非融合表達(dá)，但沒(méi)有獲得成功。

圖1 AchRα胞外肽段核酸PCR產(chǎn)物的凝膠電泳鑒定

對(duì)重組 NusA-AchR-α表達(dá)后的上清液進(jìn)行親和柱純化，SDS-PAGE分析純化結(jié)果，重組蛋白純度可達(dá)90%以上（圖3）。

2.3 NusA-AchR-α融合蛋白的Western印跡鑒定

以確診的MG患者血清為一抗與NC膜進(jìn)行孵育，Western印跡表明融合蛋白NusA-AchR-α與MG患者血清結(jié)合，在膠片上顯示出條帶（圖4）。而對(duì)照的NusA蛋白在對(duì)應(yīng)位置沒(méi)有出現(xiàn)條帶。實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，純化后的重組蛋白NusA-AchR-α相對(duì)于MG患者血清具有強(qiáng)的抗原性及特異性。

2.4 融合蛋白NusA-AchR-α的ELISA鑒定

收集200份MG患者血清和100份健康人血清對(duì)純化的NusA-AchR-α重組蛋白進(jìn)行ELISA分析，發(fā)現(xiàn)常規(guī)ELISA最佳重組抗原包被濃度為4μg/mL，96孔包被板背景較深，非特異結(jié)合較強(qiáng)，其中MG患者檢出120例，檢出率為60%；健康人血清檢出5例，特異度為95%。

圖2 pET-NusA-AchR-α原核表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE

圖3 NusA-AchR-α親和純化的SDS-PAGE分析

圖4 NusA-AchR-α和MG患者血清的Western印跡抗原性分析

3 討論

在MG患者發(fā)病過(guò)程中有多種抗體參與[3]，我院神經(jīng)內(nèi)科研究發(fā)現(xiàn)MG患者的患病程度與Titin抗體濃度呈正相關(guān)[4]。劉嵐劍等[5]研究發(fā)現(xiàn)，MG患者血清AchR抗體和Titin抗體陽(yáng)性率均明顯高于對(duì)照組，AchR抗體與Titin抗體檢測(cè)重癥肌無(wú)力的敏感度分別為76.3%和52.5%，2種抗體并聯(lián)后敏感度可提高到86.3%。通過(guò)檢測(cè)患者血清AchR抗體水平，可以初步預(yù)判MG癥狀，目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)還沒(méi)有血清學(xué)檢測(cè)MG疾病的試劑，臨床檢測(cè)主要依賴國(guó)外進(jìn)口試劑盒。為了對(duì)AchR抗體進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)，我們嘗試對(duì)AchR的α亞基胞外段進(jìn)行體外重組。同時(shí)，參考NusA蛋白標(biāo)簽系統(tǒng)能顯著提高外源蛋白的可溶性表達(dá)功能，并且NusA標(biāo)簽還能使目的蛋白仍保持正確折疊和生物學(xué)活性的作用，將AchR-α與NusA進(jìn)行融合表達(dá)，獲得了重組NusA-AchR-α的可溶性表達(dá)，在后期的ELISA實(shí)驗(yàn)中，由于顯色背景較深，陽(yáng)性檢出率不是很理想，但相對(duì)于對(duì)照血清而言還是能初步進(jìn)行甄別。后期實(shí)驗(yàn)我們將對(duì)AchR序列進(jìn)行抗原優(yōu)化以提高特異性。本實(shí)驗(yàn)為開(kāi)發(fā)MG臨床血清學(xué)診斷研究做了初步嘗試，也能為今后開(kāi)發(fā)血清學(xué)檢測(cè)試劑盒提供參考。