丁晨，肖紅劍，龍瓊，李智華，畢研偉，閆玲梅，李育中，姚月婷，寸韡

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南 昆明 650118

1957年，英國科學(xué)家AiickIsaacs和IeanLin?denmann利用雞胚絨毛尿囊研究流感病毒時，發(fā)現(xiàn)了一種可以抑制病毒增殖的物質(zhì)，他們稱之為干擾素（interferon，IFN）。干擾素是一種具有廣譜抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)活性的細胞因子，是機體細胞在受到病毒、細菌內(nèi)毒素以及其他誘生劑的刺激下，由受體細胞分泌的一種糖蛋白。IFN是一個含有許多種類的大家族，根據(jù)基因序列、染色體定位和受體特異性的不同，可分為3種類型，即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型干擾素[1]。

γ干擾素（IFNγ）是Ⅱ型干擾素，又稱為免疫干擾素，主要由活化的T細胞和NK細胞產(chǎn)生，能夠激活NK等細胞，調(diào)節(jié)巨噬細胞、T細胞、B細胞之間的關(guān)系，增強免疫應(yīng)答能力，是機體發(fā)揮免疫功能、清除體內(nèi)病原體不可缺少的成分,具有強大的免疫調(diào)節(jié)作用和抗病毒、抗腫瘤作用。由于IFNγ在機體體液免疫應(yīng)答和免疫調(diào)控中的重要作用，其在臨床中的應(yīng)用倍受青睞[2]。

目前對人和小鼠的IFNγ都有一定的研究，但樹鼩IFNγ的研究資料尚比較缺乏。氨基酸序列同源性和物種親緣分析顯示，除黑猩猩外，人與樹鼩的序列相似度最高，達68%[3]。作為一種重要的新型實驗動物，樹鼩體型小、價格低、繁殖周期短，在一些特殊疾病模型上具有獨特的優(yōu)勢，因而成為多種人類疾病研究的模型動物，在神經(jīng)科學(xué)[4]、癌癥[5]、感染與免疫[5-7]、視角系統(tǒng)缺陷[8]及生殖發(fā)育[9]等方面的研究中具有重要地位[10]。我們通過原核表達純化樹鼩IFN-γ，經(jīng)免疫家兔后鑒定其免疫原性，并檢測樹鼩不同組織中IFNγ的分布，為進一步研究樹鼩的IFNγ奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

樹鼩由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所實驗動物中心提供；家兔購自云南楚商科技有限公司。動物均在本實驗室按標準方法進行飼養(yǎng)和實驗。樹鼩麻醉處死后取心、肝、脾、肺、腎、氣管、食管、鼻組織，標注后放置于液氮內(nèi)備用。

大腸桿菌 DH5α感受態(tài)、BL21（DE3）感受態(tài)為本實驗室保藏；載體pET30a（+）、pMD19-T購于TaKaRa公司；Q5超保真DNA聚合酶，限制內(nèi)切酶NcoⅠ、HindⅢ購自 NEB 公司；TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自北京天根生化科技公司；同源重組酶購自Vazyme公司；鎳柱購自GE公司；完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑購自Sigma公司；兔抗人IFNγ單克隆抗體購自Ab?cam公司；其余試劑為國產(chǎn)分析純試劑；PCR引物及DNA測序由上海生工公司完成。

1.2 樹鼩肺組織總RNA的提取及RT-PCR擴增IFNγ基因

無菌條件下取樹鼩脾臟組織，用TRIzol法提取脾臟RNA。根據(jù)GenBank預(yù)測的樹鼩IFNγ基因序列設(shè)計引物，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。設(shè)計引物，以cDNA為模板擴增得到含有目的基因的片段。

1.3 質(zhì)粒及載體構(gòu)建

將表達載體 pET30a（+）用NcoⅠ、HindⅢ酶切后用膠回收純化試劑盒純化，PCR擴增IFNγ基因后用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化，然后將二者用同源重組酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，在卡那霉素抗性平板上挑取陽性轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒進行鑒定，正確后轉(zhuǎn)入表達宿主大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，作為工程菌株。

1.4 重組蛋白表達

挑取陽性克隆至5mL含50ng/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)，次日取1%體積轉(zhuǎn)接至 2YT培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng) 3～4h，加 1 mmol/LIPTG，30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4h后離心收集沉淀。對照組未轉(zhuǎn)入質(zhì)粒但其他培養(yǎng)條件相同。

1.5 包涵體蛋白的提取及純化

1.5.1 包涵體蛋白提取 將菌體用預(yù)冷的20 mmol/LTris·HCl（pH8.0）緩沖液重懸后超聲波破碎，離心收集沉淀，加入20mmol/LTris·HCl（pH8.0）（含1%TritonX-100）攪拌制成懸液，離心后沉淀加入 20mmol/LTris·HCl（pH8.0）（含1%TritonX-100、2mol/L尿素）攪拌制成懸液，再次離心，沉淀加入 20mmol/LTris·HCl（pH8.0）（含1mol/LNaCl）攪拌制成懸液，收集沉淀提取包涵體。

1.5.2 包涵體蛋白純化及復(fù)性 用變性溶液［6 mol/L鹽酸胍，0.5mol/LNaCl，1mmol/L β巰基乙醇溶液（pH8.0）］溶解包涵體，離心后取上清，經(jīng)鎳柱純化。按標準操作流程操作，用0.5mol/L咪唑洗脫，按峰圖分管收集樣品。選擇較純的洗脫峰樣品在 25mmol/LTris、0.1mmol/LGSSG、1 mmol/LGSH溶液中稀釋復(fù)性。

1.6 抗體制備及免疫原性檢測

將純化復(fù)性后的IFNγ與弗氏佐劑乳化后免疫家兔（每只200μg/次），第一次免疫用弗氏完全佐劑與IFNγ乳化，第2、3、4次免疫用弗氏不完全佐劑與IFNγ乳化。每2周免疫一次，免疫方式為背部皮下3點注射。第4次免疫后采血并分離血清，ELISA檢測抗體滴度，Western印跡檢測樹鼩心、肝、脾、肺、腎、氣管、食管、鼻組織中的IFNγ抗體（一抗為分離的血清1∶5000，二抗為羊抗兔HRP1∶5000）。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增IFNγ基因及其表達載體的構(gòu)建

以樹鼩脾臟總RNA為模板進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物大小與預(yù)期一致（479bp）（圖1A）。構(gòu)建的重組表達載體經(jīng)HindⅢ酶切獲得5573、256bp片段（圖1B）。測序結(jié)果與GenBank中預(yù)測的樹鼩IFNγ基因序列一致。

2.2 融合蛋白的表達

pET30a（+）-IFNγ和未轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的空載體大腸桿菌轉(zhuǎn)化子分別培養(yǎng)，30℃、1mmol/LIPTG誘導(dǎo)4h表達，經(jīng)SDS-PAGE檢測，目的蛋白相對分子質(zhì)量約為24000。由圖2可以看出，未轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的空載體經(jīng)誘導(dǎo)后未產(chǎn)生目的蛋白，而pET30a（+）-IFNγ經(jīng)誘導(dǎo)后產(chǎn)生大量目的蛋白，重組IFNγ獲得表達。

2.3 包涵體蛋白的提取及純化

pET30a（+）-IFNγ誘導(dǎo)后的菌體依次經(jīng)超聲波破碎和1%TritonX-100、2mmol/L尿素、1 mmol/LNaCl溶液溶解離心，上清中未見目的蛋白，說明IFNγ融合蛋白以包涵體形式存在（圖3A）。包涵體變性溶解后經(jīng)鎳柱純化，結(jié)果如圖3B，洗脫峰收集管1的目的蛋白條帶較純，進一步進行蛋白復(fù)性。

2.4 免疫原性鑒定

由圖4A可見，與誘導(dǎo)前、后的pET-30a（+）載體及空載體對照相比，誘導(dǎo)前可檢測出淡淡的特異性條帶，而誘導(dǎo)后的菌體出現(xiàn)很強的特異性條帶，證明免疫后得到針對IFNγ的特異性抗體。當(dāng)抗體稀釋率達到1∶10000，ELISA仍可檢測出陽性結(jié)果。

為了進一步探討IFNγ在樹鼩不同組織中的分布情況，取樹鼩不同組織勻漿后，以家兔免疫后血清為抗體進行Western印跡，結(jié)果見圖4B，樹鼩的鼻、氣管、心、肝、腎及大部分肺葉中均能檢測到IFNγ，而脾、食管及少部分肺葉組織中未能檢測到IFNγ。

圖1 IFNγ基因的PCR擴增（A）及其表達載體的酶切鑒定（B）

圖2 IFNγ表達的SDS-PAGE檢測

圖3 IFNγ包涵體蛋白提取（A）及純化（B）的SDS-PAGE檢測

圖4 Western印跡檢測樹鼩組織中的IFNγ抗體

3 討論

IFNγ是可溶性糖蛋白，由于其基因序列、氨基酸個數(shù)以及有無信號肽的差別，不同物種的IFNγ差別也比較大。大部分物種的IFNγ都以同源二聚體或四聚體的形式存在，單體一般不具有活性。20世紀80年代初，人的IFN基因克隆成功后，各國學(xué)者相繼開展了動物IFN的研究[1]。相對于其他哺乳類動物而言，樹鼩作為實驗動物主要有兩大優(yōu)勢：第一，樹鼩體型小、資源豐富、實驗研究成本低，正在成為重要的常用實驗動物；第二，無論分類地位如何，樹鼩是最接近靈長類的實驗動物。在研究人類重大疾病方面，樹鼩更具有優(yōu)勢，其研究結(jié)果可能更好地模擬了人類某些疾病的生理病理變化。但是對樹鼩進化地位、基因和有關(guān)蛋白的功能差異的探索還很有限，制約了其廣泛應(yīng)用。

原核表達重組蛋白具有操作簡單、蛋白表達量高、易于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)等優(yōu)點，因此本研究采用原核表達系統(tǒng)誘導(dǎo)表達樹鼩IFNγ，獲得大量以包涵體形式存在的目的蛋白。研究選用的表達載體pET-30a（+）帶有2個His標簽，為后期的蛋白純化提供了方便。包涵體蛋白變性后采用His-tag親和層析柱純化，獲得了純度較高的目的蛋白。經(jīng)免疫家兔后，Western印跡分析和樹鼩IFNγELISA檢測顯示蛋白產(chǎn)生了良好的免疫原性，并且在樹鼩不同組織中檢測到IFNγ的分布情況有差異，在樹鼩的鼻、氣管、心、肝、腎及大部分肺葉中均能檢測到IFNγ，而在脾、食管及少部分肺葉組織中未能檢測到。我們推斷，在鼻、氣管、肝和腎中檢測到的IFNγ蛋白為同源二聚體結(jié)構(gòu)。有關(guān)IFNγ的分布與其具有的生物學(xué)功能的相關(guān)聯(lián)系還須進一步研究。

參考文獻