楊筱舟，王晶，夏文躍，潘小霞，趙冰心，滕玉梅，文喻玲，陳元鼎

1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院＆北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650118；2.云南民族大學(xué) 化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，民族藥資源化學(xué)國(guó)家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650118

輪狀病毒（rotavirus，RV）是人和動(dòng)物腹瀉的主要病原體，為正二十面體顆粒，含3層病毒衣殼，屬于呼腸病毒科（Reovirudae）。RV一種分節(jié)段、無(wú)包膜的由11個(gè)雙鏈RNA片段組成的病毒，可編碼6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（VP）和6個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（NSP）[1]。根據(jù)組抗原蛋白VP6的血清型可將現(xiàn)有RV分為A～H共8個(gè)組，A、B、C、H組的RV可感染人類(lèi)[2]。A組RV是引起嬰幼兒病毒性腹瀉的主要病原體。根據(jù)非糖基化刺突蛋白VP4和糖蛋白VP7編碼基因的同源性差異，可將A組RV進(jìn)行基因分型，目前共有27個(gè)G（VP7）型和37個(gè)P型（VP4）[3]。VP6是RV組抗原蛋白，最保守且最豐富，約占病毒結(jié)構(gòu)蛋白總量的39%[4]。

至今尚無(wú)治療RV感染的特效藥物，疫苗仍是預(yù)防RV感染的最有效方法。作為全球首個(gè)口服輪狀病毒疫苗，恒河猴人重組輪狀病毒疫苗于1998年在美國(guó)上市，但由于存在腸套疊風(fēng)險(xiǎn)，一年后退出市場(chǎng)。隨后使用最多的是RV減毒活疫苗，如英國(guó)產(chǎn)Rotarix疫苗，它是由G1P［8］病毒株所制備的口服減毒活疫苗，兒童接種Rotarix疫苗后抗輪狀病毒IgA抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率在新加坡地區(qū)可高達(dá)93.0%，在印度地區(qū)則較低，最高達(dá)67.4%[5]。Rotarix對(duì)不同型別輪狀病毒的有效性存在差異，比如對(duì)G1野生型的平均有效性達(dá)64.1%，對(duì)非G1型輪狀病毒的平均有效性達(dá)59.7%，對(duì)P［4］型的平均有效性達(dá)70.9%，對(duì)P［6］型的平均有效性達(dá)55.2%，對(duì)P［8］型的平均有效性達(dá)59.1%[6]。此外還有美國(guó)產(chǎn)的RotaTeq疫苗，它是人牛（WC3）重配株，含5種重配輪狀病毒的口服減毒活疫苗，其中1個(gè)表達(dá)人RVP［8］型重配株，4個(gè)表達(dá)人RV（G1-G4型）重配株[7]，美國(guó)及芬蘭的兒童在接種RV5疫苗的抗輪狀病毒IgA陽(yáng)轉(zhuǎn)率可高達(dá)95.5%，在非洲的效率較差，最高可達(dá)82.5%[8-9]。美國(guó)利用VDS分析方法對(duì)RotaTeq進(jìn)行安全檢測(cè)后，發(fā)現(xiàn)服用RotaTeq兒童的腸套疊及其他不良反應(yīng)發(fā)生率與正常組比較未見(jiàn)顯著差異[10]。目前，我國(guó)自己生產(chǎn)的RV口服疫苗是蘭州生物制品研究所的羅威特疫苗（LLR）。LLR是由羔羊體內(nèi)血清型為G10P［15］的羊輪狀病毒制備的單價(jià)輪狀病毒疫苗，相關(guān)研究顯示其平均保護(hù)率僅為76%[11]。RV口服減毒活疫苗雖為人們帶來(lái)福音，但同時(shí)也存在一定的問(wèn)題，如疫苗安全性問(wèn)題，可能會(huì)發(fā)生毒株基因重配，從而引起其他疾??；疫苗污染問(wèn)題，2010年美國(guó)FDA在Rotarix和RotaTeq中發(fā)現(xiàn)了豬圓環(huán)病毒1型的DNA片段[12]；疫苗保護(hù)效果問(wèn)題，不同地區(qū)的保護(hù)效果及有效性存在一定的差異，例如Rotarix和RotaTeq在發(fā)展中國(guó)家的保護(hù)性遠(yuǎn)低于發(fā)達(dá)國(guó)家。

脊髓灰質(zhì)炎病毒（poliovirus，PV）屬微小核糖核酸病毒科（Picornaviridae），腸道病毒屬（Entero?virus）?；蚪M為正向單鏈RNA，約7.5kb，是由十二個(gè)五聚體構(gòu)成的二十面體病毒顆粒[13]，可編碼VP4、VP2、VP3和 VP1共 4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白及 2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D共7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白[14]。根據(jù)病毒毒株的不同抗原性，PV被分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ等3種血清型，血清型之間無(wú)交叉免疫反應(yīng)。人是脊灰病毒惟一的自然宿主，會(huì)導(dǎo)致肢體肌肉發(fā)生不對(duì)稱(chēng)弛緩性麻痹，也稱(chēng)小兒麻痹癥[15-16]。

脊灰病毒引起的脊髓灰質(zhì)炎目前只能通過(guò)疫苗進(jìn)行預(yù)防[17]，如口服脊灰減毒活疫苗OPV和滅活疫苗IPV。但隨著OPV的使用，疫苗相關(guān)麻痹性脊髓灰質(zhì)炎（vaccine-associated paralytic po?liomyelitis，VAPP）和疫苗衍生脊髓灰質(zhì)炎病毒（vaccine-derived poliovirus，VDPV）問(wèn)題隨之出現(xiàn)。VAPP會(huì)使因個(gè)體差異或具有免疫功能缺陷的接種者在接種過(guò)程中產(chǎn)生麻痹型脊灰問(wèn)題，而VDPV會(huì)使已消除脊灰病毒的國(guó)家因?yàn)槔^續(xù)使用OPV而產(chǎn)生疫苗衍生脊灰病毒[18]，進(jìn)而會(huì)產(chǎn)生循環(huán)，形成 cVDPV（circulating vaccine-derived polio?viruses）[19]。IPV一般采用注射形式接種，且不存在上述OPV所引起的疫苗衍生病例，目前較為推廣的是利用Sabin株病毒生產(chǎn)的IPV。

綜上所述，由于現(xiàn)有的RV和PV疫苗都存在一定的弊端，因此研發(fā)新的疫苗是當(dāng)今趨勢(shì)。在此，我們通過(guò)分子克隆技術(shù)構(gòu)建了包含RVVP6和PV3抗原表位1的載體質(zhì)粒，在大腸桿菌中表達(dá)嵌合蛋白，為新型RV、PV疫苗和疫苗載體研究提供了新的方向，并有助于其開(kāi)發(fā)利用。

1 材料和方法

1.1 材料

用于基因克隆和擴(kuò)增的大腸桿菌DH5α以及用于蛋白表達(dá)的大腸桿菌BL21（DE3）由本實(shí)驗(yàn)室提供；RVSA11株和PVⅢ型457PfizerRS1（PV3）來(lái)自世界衛(wèi)生組織（WHO）；表達(dá)質(zhì)粒pETL由本實(shí)驗(yàn)室自pET-3a改造而來(lái)；豚鼠抗載體蛋白VP6F血清抗體、抗輪狀病毒W(wǎng)a株血清抗體和抗PV3血清抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備；限制性?xún)?nèi)切酶、250bpDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)和T4DNA連接酶等購(gòu)自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗豚鼠IgG（含輕鏈和重鏈）購(gòu)自KPL公司；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）購(gòu)自Sigma公司。

1.2 pETP6F載體蛋白質(zhì)粒的構(gòu)建

克隆重組人RVTB-Chen株VP6的cDNA，在編碼VP6蛋白結(jié)構(gòu)表面位置插入6個(gè)內(nèi)切酶位點(diǎn)（SacⅠ、BspT104、KpnⅠ、BlnⅠ、SacⅡ和XhoⅠ），得到含6個(gè)插入位點(diǎn)I1、I2、I3、I4、I5、I6的重組載體蛋白VP6F（380氨基酸殘基，相對(duì)分子質(zhì)量為43200）的編碼DNA。將重組載體蛋白VP6F編碼DNA插入空載體質(zhì)粒pETL的NdeⅠ/BamHⅠ克隆位點(diǎn)，構(gòu)建攜帶載體蛋白VP6F編碼DNA的重組表達(dá)質(zhì)粒pETP6F。

Aim: The aim of the study was to perform a comparative evaluation of the use of various methods of reconstructive assistance in the repair of the femoral-tibial segment in patients with peripheral arterial disease.

1.3 重組抗原表位

選取PV3中和位點(diǎn)1（NAg1）的氨基酸序列作為外源抗原表位（命名為PV3N1），其基因序列為GAGGTGGACAATGAACAAACCACCCGGGCACAGA AG，對(duì)應(yīng)的氨基酸序列為EVDNEQPTTRAQK。人工合成編碼抗原表位PV3N1的互補(bǔ)核苷酸引物，兩端引入XhoⅠ酶切位點(diǎn)，上游引物為PV3/N1-308X-F：TCGAGGTGGACAATGAACAACCAACCA CCCGGGCACAGAAGC，下游引物為PV3/N1-308XR：TCGAGCTTCTGTGCCCGGGTGGTTGGTTGTTCA TTGTCCACC。將設(shè)計(jì)合成的互補(bǔ)引物片段進(jìn)行退火，制備插入片段，并在T4DNA連接酶的作用下，插入VP6F載體蛋白上的I6位點(diǎn)。

1.4 嵌合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將抗原表位嵌合蛋白編碼基因重組連接到pETL質(zhì)粒的NdeⅠ/BamHⅠ克隆位點(diǎn)上，構(gòu)建在VP6F上攜帶PV3抗原表位基因的重組嵌合表達(dá)質(zhì)粒pETP6F/PV3N1。經(jīng)雙酶切反應(yīng)鑒定該重組嵌合表達(dá)質(zhì)粒連接成功，通過(guò)DNA測(cè)序確定目的基因正確完整。

1.5 重組嵌合蛋白的表達(dá)

將重組質(zhì)粒pETP6F、pETP6F308X/PV3V1分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α進(jìn)行表達(dá)，并利用堿裂解法提取大腸桿菌DH5α中的質(zhì)粒DNA，經(jīng)酶切鑒定及DNA測(cè)序確定。再將重組質(zhì)粒pETP6F、pETP6F308X/PV3V1分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上于37℃表達(dá)。

1.6 重組嵌合蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)及純化

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)液于4℃、4000r/min離心8min，菌體沉淀用超聲波裂解緩沖液［200mmol/LNaCl，50mmol/LTris（pH7.5），5%甘油，5%Triton X-100，2mmol/LEDTA（pH8.0），0.2% β巰基乙醇］懸浮，于冰水浴中超聲波裂解30min，功率30%，裂解液經(jīng)4℃、12000r/min離心30min，沉淀（包涵體）蛋白溶于8mol/L尿素，分裝，保存待檢。

溶解于8mol/L尿素中的包涵體蛋白通過(guò)10%SDS-PAGE檢測(cè)及分離純化（電壓130V，電流150mA，功率90W）。約電泳6h，溴酚藍(lán)跑到膠面的最下端，取下凝膠，放入150mmol/L KCl中顯色，當(dāng)凝膠上出現(xiàn)明顯條帶時(shí)切下重組蛋白目的條帶，放入12%SDS-PAGE的凝膠柱中電泳（20mA，4℃，15h），富集到與凝膠柱相連的盛有不含SDS的電泳液的回收杯中，收集蛋白回收液，加入疊氮化鈉，分裝，-20℃保存。

1.7 Western印跡

用載體蛋白和PV免疫動(dòng)物血清抗體對(duì)重組蛋白進(jìn)行Western印跡檢測(cè)。用半干轉(zhuǎn)印法將SDS-PAGE分離的凝膠上的嵌合蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上（恒壓15V，時(shí)間30min），用5%脫脂奶粉（TBS稀釋?zhuān)┯?℃封閉過(guò)夜，加入抗VP6F或抗PV豚鼠免疫血清抗體（一抗，1∶500稀釋?zhuān)?7℃孵育 1.5h，TBS-T（加入 0.05%Tween-20的TBS）漂洗5次，每次5min，加入HRP標(biāo)記的羊抗豚鼠 IgG（二抗，1∶2000稀釋?zhuān)?7℃孵育 1h；TBS-T漂洗5次，每次5min，將膜放入DAB溶液（10mg/mL，TBS稀釋?zhuān)褂们凹尤?0%過(guò)氧化氫溶液）顯色，蒸餾水漂洗終止顯色，拍照。

2 結(jié)果

2.1 重組嵌合蛋白表達(dá)載體質(zhì)粒的構(gòu)建

用分子克隆手段構(gòu)建載體蛋白VP6F表達(dá)質(zhì)粒pETP6F及嵌合蛋白表達(dá)質(zhì)粒pETP6F/PV3N1，經(jīng)BlnⅠ/BamHⅠ雙酶切鑒定，分別在相應(yīng)位置可見(jiàn)約370和410bp的條帶（圖1），與預(yù)期相符，表明嵌合蛋白基因中成功插入PV3NAg1處的抗原表位基因。經(jīng)DNA測(cè)序，確認(rèn)所構(gòu)建的質(zhì)粒核苷酸序列完整正確。

2.2 重組嵌合蛋白在大腸桿菌BL21（DE3）中的表達(dá)和純化

重組表達(dá)的載體蛋白VP6F和嵌合蛋白6F/PV3N1經(jīng)SDS-PAGE分離，考馬斯亮藍(lán)染色后觀察其蛋白相對(duì)分子質(zhì)量，結(jié)果如圖2。

2.3 Western印跡

載體蛋白VP6F免疫的豚鼠血清抗體能特異性結(jié)合載體蛋白VP6F和嵌合蛋白6F/PV3N1（圖3A）；輪狀病毒W(wǎng)a株免疫的豚鼠血清抗體能特異性結(jié)合載體蛋白VP6F和嵌合蛋白6F/PV3N1（圖3B）；PV3免疫的豚鼠血清抗體只能特異性結(jié)合嵌合蛋白6F/PV3N1（圖3C）；PV1免疫的豚鼠血清抗體無(wú)法特異性結(jié)合嵌合蛋白6F/PV3N1和載體蛋白VP6F（無(wú)條帶，圖未示）。

3 討論

嵌合基因是指通過(guò)基因重組技術(shù)將來(lái)源不同的DNA序列重組而成的人造基因，將其通過(guò)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生的融合蛋白稱(chēng)為嵌合蛋白。在構(gòu)建嵌合蛋白的過(guò)程中，我們首先選擇A組人RVTB-Chen株的組抗原蛋白VP6的編碼基因進(jìn)行克隆，因?yàn)閂P6蛋白是RV中含量最高、保守性最強(qiáng)的蛋白，在哺乳動(dòng)物中其同源性可高達(dá)87%～99%[20]，所以用它制備疫苗會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫原性。將VP6與空載體pETL重組后構(gòu)建載體蛋白VP6F，再將PV3抗原表位NAg1插入載體蛋白VP6F，構(gòu)建嵌合蛋白載體pET6F/PV3N1，將該載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行大量表達(dá)，獲得嵌合蛋白6F/PV3N1。通過(guò)Western印跡可觀察到6F/PV3N1可以與豚鼠抗載體蛋白VP6F血清抗體、抗輪狀病毒W(wǎng)a株血清抗體和抗PV3血清抗體產(chǎn)生特異性結(jié)合，但不能與抗PV1血清抗體產(chǎn)生反應(yīng)，證明了6F/PV3N1的免疫原性和特異性，以及PV不同血清型間不產(chǎn)生交叉反應(yīng)。該實(shí)驗(yàn)為RV和PV疫苗的發(fā)展提供了一定的基礎(chǔ)。

圖1 重組質(zhì)粒BlnⅠ/BamHⅠ雙酶切的瓊脂糖凝膠電泳M：250bpDNAmarker；1：pETP6F；2：pETP6F/PV3N1

圖2 載體蛋白和重組嵌合蛋白的SDS-PAGE

圖3 VP6F（A）、輪狀病毒W(wǎng)a株（B）、PV（C）免疫豚鼠血清抗體的Western印跡