孫杰，常正堯，張曉明，王晶

1.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 毒物藥物研究所，北京 100850；2.解放軍第302醫(yī)院，北京 100039；3.空軍軍醫(yī)大學(xué)，陜西 西安 710032

c-JunN 端激酶激酶 2（c-JunN-terminalki?nasekinase2，JNKK2）是 c-JunN端激酶（c-Jun N-terminalkinase，JNK）的上游激酶，也被稱為絲裂原激活的蛋白激酶激酶7（mitogen-activated proteinkinasekinase7，MKK7），其調(diào)控著機(jī)體內(nèi)眾多生理進(jìn)程，包括細(xì)胞增殖、分化、遷移和凋亡等[1-2]。既往研究及我們課題組前期的工作發(fā)現(xiàn)，JNKK2分子參與調(diào)控多種腫瘤的惡性增殖[3-6]。然而目前有關(guān)JNKK2在肝臟中的功能及調(diào)節(jié)機(jī)制研究還較少。酵母雙雜交系統(tǒng)是一種可以快速、直接分析已知蛋白之間相互作用的常用方法，可用于分離與已知蛋白存在相互作用的配體，并明確其編碼基因。該系統(tǒng)具有簡(jiǎn)便、高效、靈敏等特征，并能反映不同蛋白在細(xì)胞內(nèi)的相互作用，常被用于基因的功能研究[7-8]。因此，為了探究JNKK2在肝臟中的調(diào)節(jié)機(jī)制，我們利用酵母雙雜交系統(tǒng)，從人胎肝cDNA文庫(kù)中篩選出能與JNKK2相互作用的蛋白，期望找到調(diào)控JNKK2-JNK信號(hào)通路的新分子，進(jìn)而為更好地理解JNK信號(hào)通路在肝臟中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

JNKK2KM質(zhì)粒、GFP-JNKK2質(zhì)粒由本室張紀(jì)巖教授提供[4]；酵母菌株 AH109（MATa），誘餌載體質(zhì)粒pGBKT7，文庫(kù)載體質(zhì)粒pGADT7，對(duì)照質(zhì)粒 pGBKT7-53、pGBKT7-Lam、pGADT7-T、pCL1，預(yù)轉(zhuǎn)化的人胚胎肝臟cDNA文庫(kù)，營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng) 基 ，X-α-gal，抗 GAL4DNA-BD 多 抗 購(gòu) 自Clontech公司；YPDA培養(yǎng)板購(gòu)自青島海博生物科技有限公司；鮭魚(yú)精DNA（CarrierDNA）、玻璃珠、3-AT、PEG3350、溶壁酶、苯甲脒、DMSO、PMSF、抗Flag標(biāo)簽抗體購(gòu)自Sigma公司；無(wú)氨基酸酵母氮源（YNB）購(gòu)自Difco公司；蛋白A/G瓊脂糖珠購(gòu)自SantaCruz公司；DNA聚合酶Pyrobest及其緩沖液、dNTPs購(gòu)自TaKaRa公司；各種限制性內(nèi)切酶及相應(yīng)緩沖液購(gòu)自NewEnglandBiolabs公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 pGBKT7-JNKK2KM誘餌載體的構(gòu)建與鑒定

根據(jù)JNKK2編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)兩端分別帶有EcoRⅠ、BamHⅠ酶切位點(diǎn)的特異性引物JNKK2-P5 （5′-CCGGAATTCATGGCGGCGTCCTCCCTGGA ACAG-3′）和 JNKK2-P3（5′-CGCGGATCCTTACTC AGTCTTCGCCATGACATC-3′）。以 JNKK2KM 質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增JNKK2KM編碼區(qū)片段（PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，56℃退火 40s，72℃延伸 90s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min）。PCR產(chǎn)物片段與pGBKT7空載體質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切，用DNA連接酶于16℃連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑單克隆進(jìn)行菌落PCR并提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后，經(jīng)12g/L瓊脂糖電泳分析，對(duì)PCR及酶切鑒定均為陽(yáng)性的克隆進(jìn)行基因測(cè)序鑒定。

1.3 誘餌質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及表達(dá)鑒定

將pGBKT7-JNKK2KM轉(zhuǎn)化AH109酵母菌（參照Clontech MatchmakerPretransformed Libraries UserManual），以AH109/pGBKT7和AH109空菌分別作為空載體對(duì)照和空白對(duì)照，涂布SD/-Trp或YPDA平板，置30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5d，從平板上分別挑取AH109/pGBKT7-JNKK2KM及AH109/pGBKT7轉(zhuǎn)化的單克隆，接種至SD/-Trp液體培養(yǎng)基中，以未轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的AH109菌落接種至YPDA培養(yǎng)液中，30℃、250r/min振蕩培養(yǎng)20h，通過(guò)免疫印跡驗(yàn)證BD-JNKK2KM融合蛋白的表達(dá)[3-5]。

1.4 酵母雙雜交系統(tǒng)從人胎肝cDNA文庫(kù)中篩選與JNNK2相互作用的蛋白

挑取新鮮含誘餌基因的酵母菌落至50mL SD/-Trp培養(yǎng)基中，充分混勻，30℃、250～270r/min培養(yǎng) 16～20h至D600nm＞0.8；1000r/min離心菌液 5 min，棄上清，用 4～5mLSD/-Trp培養(yǎng)基重懸，調(diào)整酵母細(xì)胞濃度，使終濃度大于1×108/mL。室溫水浴解凍1支含預(yù)轉(zhuǎn)化文庫(kù)的Y187酵母菌液，將上述過(guò)夜培養(yǎng)的5mLAH109誘餌菌液與1mL預(yù)轉(zhuǎn)化文庫(kù)菌液在2L無(wú)菌燒瓶中混勻，加入2×YPDA/Kana培養(yǎng)基（含50g/mL卡那霉素），定容至 50mL；30℃、30～50r/min 培養(yǎng) 20～24h；離心收集交配液，沉淀用10mL0.5×YPDA/Kana培養(yǎng)基重懸。用無(wú)菌涂棒，按200μL/平板，均勻涂布交配液到 55塊 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp（QDO）四缺陷選擇培養(yǎng)板上（150mm），30℃恒溫培養(yǎng)8～21d；同時(shí)按比例稀釋交配液分別涂于SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Leu/Trp平板上（100mm），30℃恒溫培養(yǎng)3～5d，計(jì)數(shù)菌落數(shù)，計(jì)算交配效率。

1.5 陽(yáng)性克隆的分離與驗(yàn)證

將上述可見(jiàn)克隆分別用無(wú)菌牙簽挑出，在SD/-Leu/-Trp平板上劃線，分離單克??；分別從每塊SD/-Leu/-Trp板上挑取2個(gè)單克隆，涂在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal（加入合適濃度的3-AT）培養(yǎng)板上；30℃培養(yǎng) 48～72h；藍(lán)色菌落為陽(yáng)性結(jié)果，陰性結(jié)果呈粉紅色；選取陽(yáng)性克隆再重復(fù)分離培養(yǎng)2～3輪。取3輪均變藍(lán)的陽(yáng)性克隆，進(jìn)行擴(kuò)增、抽提酵母質(zhì)粒（按照Tiangen酵母質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書(shū)），PCR鑒定。同時(shí)PCR陽(yáng)性的克隆酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α宿主菌，涂在含氨芐青霉素（Amp）的LB培養(yǎng)板上，37℃倒置培養(yǎng)12h，挑取單克隆，用含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，提取大腸桿菌質(zhì)粒；用HindⅢ限制性酶酶切鑒定。

1.6 陽(yáng)性克隆基因測(cè)序與分析

利用文庫(kù)載體pGADT7對(duì)應(yīng)的常規(guī)AD測(cè)序引物對(duì)獲得的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，上游引物為 5′-CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAAC CC-3′，下 游 引 物 為 5′-GTGAACTTGCGGGGTTTT TCAGTATCTACGAT-3′）。 測(cè) 得 的 DNA 序 列 用DNAMAN軟件進(jìn)行編輯，刪除載體序列后剩余部分為插入文庫(kù)基因；再利用NCBI網(wǎng)站BLASTN程序（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blastn）搜索同源序列并記錄，優(yōu)先選取同源性高且經(jīng)過(guò)人工注釋的序列；序列比對(duì)后，對(duì)相位正確的cDNA進(jìn)一步分析編碼蛋白的來(lái)源、功能等相關(guān)信息，去除公認(rèn)的假陽(yáng)性蛋白如線粒體蛋白、細(xì)胞骨架等。

1.7 免疫共沉淀驗(yàn)證陽(yáng)性克隆與JNKK2蛋白的相互作用

挑取陽(yáng)性克隆基因，構(gòu)建到pcDNA3.1（-）真核表達(dá)載體上，用LipofectAMINE2000分別將1 μgORF60、GNB2L1、UBA3表達(dá)質(zhì)粒及pcDNA3.1（-）空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，同時(shí)共轉(zhuǎn)1μg GFP-JNKK2質(zhì)粒；用預(yù)冷的Co-IP裂解液裂解細(xì)胞，裂解液加入1μLM2抗Flag抗體及20μL蛋白A/G瓊脂糖珠，在旋轉(zhuǎn)混合儀上于4℃旋轉(zhuǎn)過(guò)夜；用預(yù)冷的Co-IP裂解液洗蛋白A/G瓊脂糖珠3～5次，棄上清；加入20 μL2×SDS上樣緩沖液，進(jìn)行蛋白電泳和免疫印跡檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 pGBKT7-JNKK2KM誘餌載體構(gòu)建

構(gòu)建好的載體經(jīng)菌落PCR（圖1A）及EcoRⅠ/BamHⅠ酶切（圖1B）均能得到1200bp的JNKK2 DNA插入片段，測(cè)序后進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與JNKK2KM基因序列相同，表明誘餌質(zhì)粒pGBKT7-JNKK2KM構(gòu)建成功。

2.2 誘餌AH109酵母菌重組子的鑒定

挑出誘餌酵母克隆，培養(yǎng)擴(kuò)增后提取酵母質(zhì)粒，PCR鑒定重組質(zhì)粒，3個(gè)克隆在1200bp處均有JNKK2KM目的條帶，表明轉(zhuǎn)化成功（圖2A）。提取含有重組轉(zhuǎn)化子的AH109菌總蛋白進(jìn)行蛋白電泳，再用抗GAL4DNA-BD抗體檢測(cè)誘餌蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示在相對(duì)分子質(zhì)量73×103處有BD-JNKK2融合蛋白的表達(dá)（圖2B），表明含誘餌重組子的AH109酵母菌構(gòu)建成功。

圖1 誘餌載體pGBKT7-JNKK2的構(gòu)建

圖2 誘餌蛋白的表達(dá)檢測(cè)

2.3 重組誘餌表達(dá)質(zhì)粒pGBKT7-JNKK2KM毒性與自我激活性檢測(cè)

將上述重組成功的pGBKT7-JNKK2KM與空載體pGBKT7分別轉(zhuǎn)入AH109酵母菌，觀測(cè)其在SD/-Trp平板上生長(zhǎng)狀況。結(jié)果顯示含誘餌質(zhì)粒的AH109酵母菌在SD/-Trp上生長(zhǎng)良好，二者生長(zhǎng)速度相近、克隆大小相當(dāng)，表明誘餌質(zhì)粒對(duì)宿主酵母沒(méi)有明顯毒性（圖3A）。同時(shí)自我激活實(shí)驗(yàn)顯示AH109/pGBKT7-JNKK2KM在SD/-Ade/-His/-Trp/X-α-Gal平板上不能生長(zhǎng)，也不能使X-α-Gal平板變藍(lán)（圖3B），排除了pGBKT7-JNKK2K具有自激活宿主菌AH109的作用。說(shuō)明構(gòu)建的誘餌表達(dá)載體pGBKT7-JNKK2KM可用于酵母雙雜交系統(tǒng)，通過(guò)文庫(kù)篩選相互作用蛋白。

2.4 cDNA文庫(kù)交配效率計(jì)算

交配液涂板前，取出10μL按表1中比例稀釋，取出100μL分別接種至SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Leu/-Trp平板，倒置培養(yǎng)克隆，生長(zhǎng)計(jì)數(shù)見(jiàn)表1。已知2個(gè)交配伴侶的各自活力大小，較少的一方處于“限制性位置”。本實(shí)驗(yàn)中交配效率（二倍體數(shù)/限制方菌落數(shù)×100%=664/1469×100%=45.2%）遠(yuǎn)高于2%的最低篩選要求。

2.5 陽(yáng)性克隆的分離與驗(yàn)證

AH109/pGBKT7-JNKK2KM與Y187文庫(kù)酵母菌接合培養(yǎng)，在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/平板上陸續(xù)收集＞2mm的酵母菌落，共計(jì)120個(gè)。經(jīng)SD/-Leu/-Trp板劃線分離，挑取出3個(gè)克隆再涂在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal或 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/H2O平板上進(jìn)行驗(yàn)證，變藍(lán)色為陽(yáng)性克?。▓D4A）。陽(yáng)性克隆再次劃線分離與驗(yàn)證2～3次，最后選取每次驗(yàn)證均變藍(lán)色的克隆32個(gè)。提取酵母質(zhì)粒，用pGADT7載體對(duì)應(yīng)的常規(guī)AD引物做PCR鑒定，獲得11個(gè)陽(yáng)性克隆，后經(jīng)將酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，提取大腸桿菌質(zhì)粒，用HindⅢ酶切鑒定，結(jié)果顯示11個(gè)克隆酶切結(jié)果均為陽(yáng)性（圖4B）。

2.6 陽(yáng)性克隆基因序列的測(cè)定與分析

用pGADT7載體對(duì)應(yīng)的常規(guī)AD測(cè)序引物[9]對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，分析插入文庫(kù)cDNA序列。序列結(jié)果用NCBI的BLAST在線比對(duì)工具進(jìn)行比對(duì)。把測(cè)序結(jié)果中相位正確的克隆確認(rèn)為真正的陽(yáng)性克隆，最終確定11個(gè)陽(yáng)性克隆中有3個(gè)為已知的編碼基因（表2）。經(jīng)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，6號(hào)克隆與泛素樣修飾物激活酶3（UBA3）編碼區(qū)1335～1392位匹配，9號(hào)克隆與3號(hào)染色體開(kāi)放讀框60（ORF60）的CDS區(qū)完全匹配，25號(hào)克隆與鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白β多肽2樣蛋白1（GNB2L1）編碼區(qū)380～1060區(qū)匹配。以9號(hào)克隆質(zhì)粒為模板調(diào)取ORF60全長(zhǎng)編碼序列，以25號(hào)克隆為模板調(diào)取GNB2L1C端681bp序列（GNB2L1C）?？紤]到UBA3匹配序列較短，我們?nèi)铣蒛BA3C端1102～1392位291bp序列（UBA3C）。為便于研究以上調(diào)取的基因，我們?cè)贜端均加入Flag多肽標(biāo)簽，并克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1（-）上。

圖3 誘餌蛋白的毒性與自激活性檢測(cè)

表1 交配液按比例稀釋后在不同平板上克隆情況

2.7 免疫共沉淀驗(yàn)證陽(yáng)性克隆與JNKK2蛋白的相互作用

分別轉(zhuǎn)染 ORF60、GNB2L1C、UBA3C 質(zhì)粒到293T細(xì)胞，同時(shí)共轉(zhuǎn)GFP-JNKK2質(zhì)粒，共培養(yǎng)24h后提取細(xì)胞蛋白，用Flag抗體M2免疫沉淀目的蛋白，用兔抗人JNKK2抗體檢測(cè)相互作用條帶。結(jié)果如圖5所示，3個(gè)克隆均能不同程度地沉淀出GFP-JNKK2蛋白條帶，而空載體對(duì)照則沒(méi)有沉淀?xiàng)l帶，表明克隆均能與JNKK2蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)相互結(jié)合。

圖4 初篩克隆的驗(yàn)證

表2 篩選文庫(kù)陽(yáng)性克隆編碼基因信息

3 討論

酵母雙雜交系統(tǒng)是分析蛋白相互作用強(qiáng)有力的研究方法之一，作為篩選相互作用蛋白的工具得到了廣泛應(yīng)用[7-8]。本研究以JNKK2KM分子為“誘餌”，應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)對(duì)人胎肝文庫(kù)進(jìn)行篩選，初步篩選出120個(gè)克隆，后經(jīng)多輪篩選，合并重復(fù)序列，最終篩選出11個(gè)陽(yáng)性克隆。質(zhì)粒測(cè)序后進(jìn)行序列比對(duì)分析，得到3個(gè)編碼基因ORF60、GNB2L1、UBA3。經(jīng)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，3種蛋白均可以與JNKK2蛋白發(fā)生相互作用。

ORF60屬于線粒體復(fù)合物Ⅰ家族，相關(guān)研究較少，僅有的幾篇報(bào)道表明其對(duì)線粒體組裝至關(guān)重要；另有研究表明新生兒氧化磷酸化失能綜合征（disordersoftheoxidativephosphorylation，OX?PHOS）與其功能突變密切相關(guān)[10]。ORF60與JNKK2相互作用的生物學(xué)意義仍待進(jìn)一步挖掘。

GNB2L1屬于Gβ樣支架蛋白[11-12]，相對(duì)分子質(zhì)量約為36×103，其編碼基因位于第5號(hào)染色體的q35.3區(qū)。GNB2L1能激活蛋白激酶C（PKC），又稱為活化的蛋白激酶C受體1（receptorofacti?vatedC-kinase1，RACK1）。已發(fā)現(xiàn)能與GNB2L1結(jié)合的蛋白有近140種，其中包括許多重要的炎性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，如 PKC、MKK7、Src、PDE4D5、PI3K等[12-14]。GNB2L1作為接頭蛋白，參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、遷移、分化等過(guò)程，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[12-13]。人非小細(xì)胞肺癌中GNB2L1的mRNA水平比正常肺組織高4倍，在結(jié)腸癌中的水平比正常結(jié)腸組織高近20倍[15]。GNB2L1還在口腔鱗癌、乳腺癌和肺腺癌中高表達(dá)[16-18]。近期，顧建新課題組發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌組織中GNB2L1異常高表達(dá)，且GNB2L1與不良預(yù)后呈正相關(guān)[19]。提示GNB2L1很可能通過(guò)與JNKK2的相互作用來(lái)影響JNK活性，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生。

圖5 免疫共沉淀驗(yàn)證陽(yáng)性克隆與JNKK2蛋白的相互作用

UBA3是泛素化樣修飾E1蛋白家族成員，通過(guò)結(jié)合β淀粉樣蛋白前體蛋白結(jié)合蛋白（amyloidbeta precursorproteinbindingprotein，APPBP1）形成異二聚體，進(jìn)而激活對(duì)泛素樣蛋白NEDD8（neuralpre?cursorcell-expresseddevelopmentallydownregulated 8）的修飾作用，NEDD8修飾（neddylation）的功能主要體現(xiàn)在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)之間的相互作用、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性以及拮抗泛素化等。已有研究表明ned?dylation系統(tǒng)參與調(diào)控多種腫瘤的惡性進(jìn)程：免疫組化顯示肝內(nèi)膽管癌樣本中有2/3表現(xiàn)出neddylation E1酶（NAE1，UBA3）、E2酶（UBC12）及NEDD8高表達(dá)[20]；人惡性膠質(zhì)瘤中neddylation通路高度活化，與疾病的惡性程度正相關(guān)[21]；人肺腺癌和鱗狀細(xì)胞癌中neddylation通路同樣高度活化[22]。Neddylation抑制劑MLN4924可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞S期DNA合成紊亂，從而引起腫瘤細(xì)胞凋亡，具有很好的腫瘤治療前景，目前已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段[23]。以上提示，UBA3與JNKK2相互作用可能參與調(diào)控neddylation修飾過(guò)程，與肝癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

綜上，我們通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)篩選出調(diào)控JNKK2-JNK通路的蛋白分子，針對(duì)所篩選的蛋白與JNKK2間相互作用，及該作用在腫瘤發(fā)生發(fā)展中所發(fā)揮的病理生理學(xué)意義的研究，具有很好的研究?jī)r(jià)值。后續(xù)希望能深入探討JNKK2與新篩選蛋白間相互作用的病理生理學(xué)意義，更好地理解調(diào)控JNK-JNKK2通路的分子機(jī)制，為發(fā)現(xiàn)新的抗肝癌靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。