劉安琪 杜晶春 藍(lán)曉 陳柳池 徐霞

廣州醫(yī)科大學(xué)金域檢驗(yàn)學(xué)院（廣州510182）

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是能夠從多種組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞分離出來(lái)的一種具有分化潛能的干細(xì)胞，在骨髓中最先被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在還可從臍帶、外周血、脂肪組織、骨骼肌、羊水等［1］組織中分離獲得。能夠分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞等多種組織細(xì)胞。羊水來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞具有發(fā)育階段原始、易于獲得、不涉及倫理問(wèn)題等優(yōu)點(diǎn)。

干擾素（interferon，IFN）是由英國(guó)科學(xué)家Isaacs于1957年利用雞胚絨毛尿囊膜研究流感病毒干擾現(xiàn)象時(shí)首先發(fā)現(xiàn)的，是一類具有廣泛生物活性的細(xì)胞因子，具有抑制細(xì)胞分裂、調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、抗腫瘤等多種作用?？墒歉蓴_素在體內(nèi)半衰期很短，全身給藥達(dá)到治療效果的干擾素劑量對(duì)機(jī)體器官的毒性相當(dāng)大，因此限制了干擾素的廣泛應(yīng)用。

MSCs易于體外擴(kuò)增培養(yǎng)，具有天然免疫豁免特性以及向腫瘤細(xì)胞遷移的能力［2］，且易于被逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒等載體轉(zhuǎn)染。有文獻(xiàn)報(bào)道，慢病毒載體更適用于干細(xì)胞，其對(duì)分裂和非分裂細(xì)胞都具有感染能力［3］。因此，本實(shí)驗(yàn)考慮用hIFN?β、hIFN?γ修飾人羊水間充質(zhì)干細(xì)胞（human amniotic fluid derived mesenchymal stem cells，AFM?SCs），并成功實(shí)現(xiàn)其表達(dá)和分泌，從而為探索腫瘤的靶向基因治療提供合適的細(xì)胞載體。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 人羊水來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞：在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床產(chǎn)前診斷正常標(biāo)本中收集羊水組織培養(yǎng)獲得。293FT細(xì)胞：購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 試劑和儀器 試劑：低糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗溶液、0.25%胰酶-0.2%EDTA均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，Recombinant Human FGF?basic購(gòu)自 PeproTech 公司，BIO?AMFTM?2 培養(yǎng)基購(gòu)自以色列Biological Industries公司，Lipo?fectamine2000、opti?MEM 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó) Invitro?gen，攜帶hIFN?β、hIFN?γ、EGFP基因的質(zhì)粒購(gòu)于廣州復(fù)能生物公司，Human Interferon Beta ELISA kit、Human IFN gamma ELISA kit購(gòu)自Arigo公司，Cell Counting Kit 8購(gòu)自日本同仁公司，流式分析用抗體購(gòu)自BD公司。儀器：倒置相差顯微鏡（Leica），細(xì)胞成像儀（BioTek公司），流式分析儀（BECK?MAN公司），酶標(biāo)儀（BioTek公司）。

1.3 方法

1.3.1 人羊水間充質(zhì)干細(xì)胞的收集、培養(yǎng)和傳代擴(kuò)增 通過(guò)羊膜腔穿刺術(shù)收集少量羊水組織，1 100 r/min離心5 min棄上清，用低糖DMEM完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，4 ng/mL rBFGF）將細(xì)胞重懸后鋪在25 cm2培養(yǎng)瓶中，再按3∶1比例加入BIO?AMFTM?2培養(yǎng)基，置37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5～7 d后用0.25%胰酶消化貼壁細(xì)胞，按1∶3傳代。待細(xì)胞融合達(dá)80%左右，再用胰酶消化，每3～4天傳代1次，連續(xù)傳代3代后即可獲得形態(tài)均一的間充質(zhì)干細(xì)胞。

1.3.2 人羊水間充質(zhì)干細(xì)胞的體外誘導(dǎo)分化 （1）成骨誘導(dǎo)分化：將傳代擴(kuò)增后的第4代AFMSCs以2×104接種于6孔板，待細(xì)胞融合達(dá)到80%以上后，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，PBS洗3次，誘導(dǎo)組加入成骨誘導(dǎo)液，對(duì)照組每孔加入L?DMEM完全培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3天換1次誘導(dǎo)液，待誘導(dǎo)至第21天用茜素紅-S染色的方法對(duì)成骨誘導(dǎo)分化進(jìn)行鑒定。（2）成脂誘導(dǎo)分化：按成骨誘導(dǎo)分化的方法接種細(xì)胞，誘導(dǎo)組首先加入成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo)3 d，再用脂肪保持液處理1 d，如此循環(huán)3次，最后用脂肪保持液處理7 d。對(duì)照組加入DMEM完全培養(yǎng)基，每隔3～4 d換液。用油紅O染色法對(duì)成脂分化進(jìn)行鑒定。

1.3.3 細(xì)胞表面標(biāo)志測(cè)定 細(xì)胞長(zhǎng)滿后用0.25%胰酶消化，1 200 r/min離心3 min，棄上清，PBS緩沖液洗滌2次，均分至EP管，加入相應(yīng)的熒光標(biāo)記抗體，4℃避光孵育45 min，離心，PBS緩沖液洗去未標(biāo)記抗體，用200 μL PBS重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD34、CD44、CD105和HLA?ABC的表達(dá)。

1.3.4 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線繪制 取第7代培養(yǎng)的AFMSCs消化后鋪于96孔板孔內(nèi)，1 000個(gè)細(xì)胞/孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁狀態(tài)良好，用CCK?8試劑盒測(cè)細(xì)胞數(shù)量，每孔加10 μL試劑，反應(yīng)30 min用酶標(biāo)儀測(cè)490 nm處的吸光度。每隔一天測(cè)一次，共測(cè)5次，每次測(cè)3個(gè)孔，取平均值。

1.3.5 不同培養(yǎng)代數(shù)人羊水間充質(zhì)干細(xì)胞染色體核型的比較 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第1代AFMSCs與傳代至第30代的AFMSCs各一瓶，送往廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院做染色體核型分析。

1.3.6 重組慢病毒顆粒的制備 轉(zhuǎn)染前2 d將293FT細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%以上時(shí)，將培養(yǎng)基換成不含抗生素的H?DMEM培養(yǎng)基。配制以下混合液：A：0.5 μg表達(dá)質(zhì)粒（EGFP、hIFN?β、hIFN?γ）+SL3/SL4/SL5各0.25 μg+250 μL Opti?MEM，輕柔混勻；B：6 μL Lipo 2000+250 μL Opti?MEM，輕柔混勻，室溫放置5 min；將B液加入A液，輕輕混勻，室溫孵育15 min后，逐滴加入到含293FT細(xì)胞的6孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，6 h后換成無(wú)雙抗的H?DMEM培養(yǎng)基，48 h后收集富含慢病毒顆粒的培養(yǎng)上清。2 500 r/min離心2 min，除去細(xì)胞碎片后將含有病毒顆粒的上清液用0.45 μm濾器過(guò)濾，分裝至1.5 mL EP管中，-20℃保存。

1.3.7 重組慢病毒顆粒感染人羊水間充質(zhì)干細(xì)胞 取第4或5代狀態(tài)較好的AFMSCs鋪于6孔板內(nèi)，細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，換成新鮮培養(yǎng)液，1孔為不加任何慢病毒顆粒的陰性對(duì)照，其余3孔分別加入事先制備好的EGFP（陽(yáng)性對(duì)照）、hIFN?β、hIFN?γ（實(shí)驗(yàn)組）慢病毒顆粒，感染12 h后換為DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h，再次感染，連續(xù)感染2～3次達(dá)到較好效果，并觀察細(xì)胞狀態(tài)、熒光表達(dá)情況。

1.3.8 轉(zhuǎn)染后間充質(zhì)干細(xì)胞的純化 在轉(zhuǎn)染后第四天開(kāi)始用1～3 mg/L的嘌呤霉素進(jìn)行篩選，一般要篩選3輪，篩選的同時(shí)根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖情況傳代培養(yǎng)。

1.3.9 轉(zhuǎn)染后間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定分析 經(jīng)嘌呤霉素篩選的AFMSCs傳代至第4代時(shí)分別收集陰性對(duì)照組（AFMSCs）、陽(yáng)性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染EGFP）和實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染hIFN?β、hIFN?γ）的培養(yǎng)基上清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明檢測(cè)上清液中hIFN?β、hIFN?γ的濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中計(jì)量資料以±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人羊水間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài) 最初從羊水中分離得到的細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中成懸浮狀態(tài)，原代培養(yǎng)5～7 d貼壁生長(zhǎng)，早期貼壁細(xì)胞主要呈類上皮樣、梭形或三角形，傳代培養(yǎng)后細(xì)胞形態(tài)逐漸均一，多為成纖維樣。見(jiàn)圖1。

圖1 第4代人羊水間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)（×40）Fig.1 The morphology of the fourth generation of AFMSCs

2.2 人羊水間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向誘導(dǎo)分化能力 成骨誘導(dǎo)21 d，茜素紅染色可觀察到深褐色鈣沉積，見(jiàn)圖2A；成脂誘導(dǎo)19 d，油紅O染色可看到脂滴形成，見(jiàn)圖2B。

圖2 人羊水間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化（×100）Fig.2 Induced differentiation in vitro of AFMSCs（× 100）

2.3 細(xì)胞表面標(biāo)志測(cè)定 流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，AFMSCs不表達(dá)CD34，高表達(dá)CD44、CD105和HLA?ABC。見(jiàn)圖3。

2.4 人羊水間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 第7代細(xì)胞接種后，1 d貼壁，5 d內(nèi)為緩慢生長(zhǎng)期，5～7 d細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，7～9 d細(xì)胞達(dá)到生長(zhǎng)平臺(tái)期。見(jiàn)圖4。

2.5 不同培養(yǎng)代數(shù)人羊水間充質(zhì)干細(xì)胞染色體核型的比較 第1代AFMSCs（圖5A）與第30代AFM?SCs（圖5B）的核型比較結(jié)果顯示，染色體核型均為正常二倍體核型，染色體數(shù)目均為2n=46條，染色體G帶顯示清晰。

圖3 第4代人羊水間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志測(cè)定Fig.3 Surface marker determination of the fourth generation of AFMSCs

圖4 第7代人羊水間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth curve of the seventh generation of AFMSCs

圖5 人羊水間充質(zhì)干細(xì)胞的的染色體（×1 000）Fig.5 The chromosome of AFMSCs（× 1 000）

2.6 慢病毒的包裝結(jié)果 在熒光顯微鏡下觀察，可見(jiàn)轉(zhuǎn)染EGFP組大量293FT細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)綠色熒光，見(jiàn)圖6A，說(shuō)明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入293FT細(xì)胞效率較高；同時(shí)293FT細(xì)胞在病毒作用下融合狀態(tài)較好，見(jiàn)圖6A，B，C，有利于病毒顆粒的組裝和釋放，收集培養(yǎng)基并離心后可獲得含病毒顆粒的上清液。

圖6 慢病毒包裝結(jié)果（bar：100 μm）Fig.6 Lentivirus packaged

2.7 慢病毒轉(zhuǎn)染人羊水間充質(zhì)干細(xì)胞 能夠得到轉(zhuǎn)染效率較高的AFMSCs，目的基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。EGFP組轉(zhuǎn)染2次后AFMSCs高表達(dá)EGFP，見(jiàn)圖7A。在轉(zhuǎn)染后第四天開(kāi)始用嘌呤霉素進(jìn)行篩選，經(jīng)過(guò)3輪篩選得到穩(wěn)定表達(dá)hIFN?β、hIFN?γ的AFMSCs。

圖7 慢病毒轉(zhuǎn)染人羊水來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞（bar：200 μm）Fig.7 Lentivirus transfection of AFMSCs

2.8 干擾素β和γ修飾的人羊水間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定 Elisa檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組和EGFP組均無(wú)hIFN?β、hIFN?γ 表達(dá)，而hIFN?β 修飾的AFMSCs組中干擾素β濃度為1 830 pg/mL，hIFN?γ修飾的AFMSCs組中干擾素γ濃度為65.33 pg/mL，表明hIFN?β、hIFN?γ基因成功轉(zhuǎn)入AFMSCs中并高效表達(dá)，見(jiàn)圖8。

3 討論

關(guān)于MSCs的研究，標(biāo)本多數(shù)從骨髓或脂肪組織中獲取，但從骨髓獲取MSCs對(duì)供體身體傷害相對(duì)較大，增殖分化潛能隨年齡增大而下降；脂肪組織中所含MSCs比例較少且增殖能力不強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)從羊水中制備MSCs，具有取材相對(duì)方便和干細(xì)胞比例相對(duì)高的優(yōu)勢(shì)。目前認(rèn)為MSCs沒(méi)有特異性的表面標(biāo)志物，已有研究表明其具有上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的特征，不表達(dá)造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志。本研究的流式結(jié)果與相關(guān)報(bào)道一致，同時(shí)AFMSCs可穩(wěn)定進(jìn)行體外擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)多次傳代仍未見(jiàn)明顯衰老痕跡且能保持正常核型；具有體外多向誘導(dǎo)分化能力。

圖8 Elisa檢測(cè)EFGP、hIFN?β和hIFN?γ修飾的AFMSCs表達(dá)hIFN?β、hIFN?γ的情況Fig.8 The expression of hIFN?β、hIFN?γ of AFMSCs modified by EFGP、hIFN?β和hIFN?γ

慢病毒顆粒的組裝需要病毒包裝質(zhì)粒和表達(dá)質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)在轉(zhuǎn)染攜帶hIFN?β、hIFN?γ基因的表達(dá)質(zhì)粒的同時(shí)，另一組轉(zhuǎn)染攜帶EGFP基因的表達(dá)質(zhì)粒作為對(duì)照，因此根據(jù)綠色熒光蛋白表達(dá)情況可以判斷質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率及目的基因的表達(dá)效率。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的293FT細(xì)胞融合狀態(tài)良好，轉(zhuǎn)染率較高，為高效感染AFMSCs提供了保證。感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明攜帶EGFP的慢病毒顆粒感染AFM?SCs后能表達(dá)較強(qiáng)的綠色熒光蛋白，ELISA結(jié)果表明感染了攜帶hIFN?β、hIFN?γ的慢病毒顆粒的AFMSCs能夠有效表達(dá)分泌型hIFN?β和hIFN?γ。

最近的研究結(jié)果表明MSCs輸注具有良好的安全性和耐受性［4］，結(jié)合 MSCs的歸巢特性［2］，MSCs作為細(xì)胞載體用于基因治療的研究已經(jīng)在體外和動(dòng)物水平取得了較好的效果［5］。如IL?12修飾的MSCs抑制卵巢癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡［6］；Trail修飾的神經(jīng)干細(xì)胞可追蹤膠質(zhì)瘤細(xì)胞，并可誘發(fā)其凋亡［7］；利用慢病毒包裝系統(tǒng)制備的色素上皮衍生因子修飾的MSCs在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均可抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的能力［8］。

干擾素療法作為腫瘤治療中的重要一員，已被用于骨髓瘤［9］、惡性淋巴瘤［10］和腎細(xì)胞癌［11］等多種腫瘤的治療。臨床Ⅱ期試驗(yàn)證實(shí)靜脈注射高劑量的IFN?β對(duì)黑色素瘤可發(fā)揮抗腫瘤作用，但會(huì)產(chǎn)生副作用，如流感樣癥狀、疲勞、厭食癥等；而靜脈注射低劑量的干擾素在患者體內(nèi)很快被降解，不能發(fā)揮抗腫瘤作用［12］。將AFMSCs用干擾素修飾后，高效表達(dá)干擾素的AFMSCs有望遷移到腫瘤部位，并在腫瘤部位大量表達(dá)目的基因，從而克服干擾素在臨床應(yīng)用中半衰期短、需反復(fù)給藥以及大劑量給藥有副作用等缺點(diǎn)，有望靶向性治療腫瘤。干擾素除了具有抗腫瘤活性，還參與免疫調(diào)節(jié)。有文獻(xiàn)報(bào)道，NO是MSCs介導(dǎo)免疫抑制作用的關(guān)鍵效應(yīng)分子［13-14］，IFN?β可通過(guò)降低Stat1與iNOS啟動(dòng)子的結(jié)合來(lái)抑制MSCs產(chǎn)生NO，從而增強(qiáng)MSCs免疫反應(yīng)并發(fā)揮抗腫瘤作用［15-16］；而IFN?γ則可以誘導(dǎo)MSCs生成NO，從而間接發(fā)揮免疫抑制作用并促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)［15］。因此，干擾素修飾的MSCs輸注體內(nèi)后是否引起患者免疫功能的變化以及IFN?β和IFN?γ修飾的MSCs抗腫瘤作用的差異也有待研究。

本實(shí)驗(yàn)成功制備出hIFN?β、hIFN?γ修飾的AFMSCs，為下一步將MSCs安全、高效地應(yīng)用于腫瘤治療研究奠定了基礎(chǔ)。

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