艾有偉，侯溫甫，張潔，王宏勛

(武漢輕工大學(xué)，武漢 430023)

醬鹵肉制品是將鮮(凍)畜禽肉及可食副產(chǎn)品置于添加有食鹽、醬油(或不加)、香辛料的水中[1]，經(jīng)預(yù)煮、燒煮、醬制(鹵制)等工序加工而成[2]，集肉香、醬香于一體的休閑食品[3]。風(fēng)味獨特，品種繁多，距今有多年歷史[4]，具有巨大市場潛力[5]。以醬鹵鴨制品系列為代表的湖北肉鴨熟食產(chǎn)品，已成為湖北地方特色食品，深受國內(nèi)外消費者喜愛。

香辛料是醬鹵鴨制品加工過程中的重要原料，其含有的主效成分是形成醬鹵鴨制品獨特風(fēng)味的重要成分基礎(chǔ)?，F(xiàn)階段醬鹵制品加工工藝中香辛料多采用直接添加的方法，但受限于香辛料的品種、產(chǎn)地、收獲期、生產(chǎn)年份等差異，使得各香辛料中的主效成分存在一定的差異[6]，而直接影響到不同批次產(chǎn)品間的風(fēng)味穩(wěn)定性，一定程度影響消費者對產(chǎn)品的感官體驗。本文以醬鹵制品常用香辛料為研究對象，建立各主效成分含量的測定方法。旨在建立香辛料主效成分標準化檢測方法，為明晰不同批次、產(chǎn)地、品種中香辛料主效成分含量之間的差異提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：辣椒、花椒、八角、桂皮、陳皮、白芷、砂姜、丁香、紫蘇、黑胡椒、小茴香、肉豆蔻、當歸、香葉、草果，購于武漢舵落口香料批發(fā)市場。

標準品：辣椒素標準品、二氫辣椒素標準品、β-山椒素標準品、莽草酸標準品、桂皮醛標準品、橙皮苷標準品、歐前胡素標準品、山奈酚標準品、丁香酚標準品、紫蘇醛標準品、胡椒堿標準品、反式茴香腦、桉油精、阿魏酸(純度95%)，購于成都克洛瑪生物公司。

試劑：甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、磷酸(優(yōu)級純)、甲酸(色譜純)、乙酸(色譜純)，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；95%食用酒精；正己烷(色譜純)，德國Meker公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Aglilent 1260LC高效液相色譜儀 美國安捷倫科技公司；超純水系統(tǒng) Milli-Q Integral公司；SB-5200DTN超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；GZX-9140MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 上海博訊實業(yè)有限公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠； YB-1000A型高速多功能粉碎機 浙江省永康市速峰工貿(mào)有限公司；CP214電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司；TGL-16G離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 各香辛料中主效成分及其主效成分高效液相色譜檢測條件

15種香辛料中花椒、桂皮、陳皮、白芷、砂姜、紫蘇、黑胡椒、小茴香、八角、當歸10種香辛料對應(yīng)主效成分分別為β-山椒素、桂皮醛、陳皮苷、歐前胡素、山奈酚、紫蘇醛、胡椒堿、反式茴香腦、莽草酸、阿魏酸；辣椒中主效成分為辣椒素和二氫辣椒素；香葉、草果2種香辛料主效成分均為桉油精；丁香、肉豆蔻2種香辛料對應(yīng)主效成分均為丁香酚，故15種香辛料對應(yīng)主效成分共14種。

1.3.1.1 辣椒素和二氫辣椒素2種成分色譜檢測條件[7]

色譜柱：Aglilent Extend-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫為30 ℃，檢測波長為280 nm;采用A和B雙泵系統(tǒng)，流速為1.0 mL/min，進樣量為20 μL。流動相A為甲醇，流動相B為水(65∶35,V/V)。

1.3.1.2 桂皮醛色譜檢測條件[8]

色譜柱：Aglilent Extend-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫為25 ℃，檢測波長為290 nm;采用A和B雙泵系統(tǒng)，流速為1.0 mL/min，進樣量為20 μL。流動相A為乙腈，流動相B為水(32∶68,V/V)。

1.3.1.3 陳皮苷色譜檢測條件[9]

色譜柱：Aglilent Extend-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫為30 ℃，檢測波長為283 nm;采用A和B雙泵系統(tǒng)，流速為1.0 mL/min，進樣量為20 μL。流動相A為乙腈，流動相B為水(pH 3,23∶77,V/V)。

1.3.1.4 胡椒堿色譜檢測條件[10]

色譜柱：Aglilent Extend-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫為30 ℃，檢測波長為343 nm;采用A和B雙泵系統(tǒng)，流速為1.0 mL/min，進樣量為20 μL。流動相A為乙腈，流動相B為水(40∶60,V/V)。

1.3.1.5 丁香酚色譜檢測條件[11]

色譜柱：Aglilent Extend-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫為30 ℃，檢測波長為270 nm;采用A和B雙泵系統(tǒng)，流速為1.0 mL/min，進樣量為20 μL。流動相A為甲醇，流動相B為0.2%磷酸溶液(70∶30,V/V)。

1.3.1.6 β-山椒素色譜檢測條件[12]

色譜柱：Aglilent Extend-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫為30 ℃，檢測波長為254 nm;采用A和B雙泵系統(tǒng)，流速為1.0 mL/min，進樣量為20 μL。流動相A為乙腈，流動相B為0.1%甲酸水溶液(45∶55,V/V)。

1.3.1.7 山奈酚色譜檢測條件[13]

1.3.1.8 歐前胡素色譜檢測條件[14]

色譜柱：Aglilent Extend-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫為30 ℃，檢測波長為247 nm;采用A和B雙泵系統(tǒng)，流速為1.0 mL/min，進樣量為20 μL。流動相A為乙腈，流動相B為水(65∶35,V/V)。

1.3.1.9 紫蘇醛色譜檢測條件[15]

色譜柱：Aglilent Extend-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫為30 ℃，檢測波長為230 nm;采用A和B雙泵系統(tǒng)，流速為1.0 mL/min，進樣量為20 μL。流動相A為乙腈，流動相B為水(75∶25,V/V)。

1.3.1.10 反式茴香腦色譜檢測條件[16]

色譜柱：Aglilent Extend-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫為30 ℃，檢測波長為254 nm;采用A和B雙泵系統(tǒng)，流速為1.0 mL/min，進樣量為20 μL。流動相A為甲醇，流動相B為水(80∶20,V/V)。

1.3.1.11 莽草酸色譜檢測條件[17]

色譜柱：Aglilent Extend-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫為30 ℃，檢測波長為210 nm;采用A和B雙泵系統(tǒng)，流速為1.0 mL/min，進樣量為20 μL。流動相A為乙腈，流動相B為0.5%磷酸水溶液(體積比95∶5,V/V)。

橡膠圈外觀質(zhì)量應(yīng)符合以下要求：顏色均勻，表面不應(yīng)有游離硫；材質(zhì)致密，無肉眼可見的雜質(zhì)、氣孔、裂縫及其他有礙使用的缺陷；單個橡膠圈上凹凸不超過1 mm，面積不超過6 mm2，且不多于3處；飛邊須除凈，其厚度不應(yīng)超過0.4 mm，剪損寬度應(yīng)不超過0.8 mm；無平面扭曲現(xiàn)象，帶接頭的橡膠圈，接頭處應(yīng)平順無分離跡象，接頭處錯位不應(yīng)超過0.5 mm；每個橡膠圈只容許有1個接頭。

1.3.1.12 桉油精色譜檢測條件[18]

色譜柱：Aglilent Extend-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫為40 ℃，檢測波長為203 nm;采用A和B雙泵系統(tǒng)，流速為1.0 mL/min，進樣量為20 μL。流動相A為乙腈，流動相B為水(70∶30,V/V)。

1.3.1.13 阿魏酸色譜檢測條件[19]

色譜柱Aglilent Extend-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫為40 ℃，檢測波長為323 nm;采用A和B雙泵系統(tǒng)，流速為1.0 mL/min，進樣量為20 μL。流動相A為乙腈，流動相B為乙酸溶液(pH 3,15∶85,V/V)。

1.3.2 香辛料提取液制備

將15種香辛料樣品分別于65 ℃干燥4 h，經(jīng)粉碎過60目篩。精確稱取香辛料樣品各5.00 g，加入60%食用酒精100 mL，于60 ℃下超聲提取2 h。靜置10 min后過濾濃縮定容至50 mL，經(jīng)0.45 μm有機濾膜過濾后進行色譜分析。

1.3.3 香辛料主效成分標準品溶液制備方法

分別精確稱取1.3.1中14種香辛料主效成分標準品用其相對應(yīng)流動相超聲溶解后配制成14種標準品溶液，經(jīng)0.45 μm有機濾膜過濾后進行色譜分析。

1.3.4 傳統(tǒng)鹵水檢測前處理方法

取100 g傳統(tǒng)鹵水樣品加熱融化并除去表面油脂，逐個分裝至2.5 mL離心管中于12000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min去除鹵水中的殘渣并取上清液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后進行色譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 14種主效成分標準品檢測結(jié)果

精密吸取辣椒素標準品、二氫辣椒素標準品、β-山椒素標準品、桂皮醛標準品、橙皮苷標準品、歐前胡素標準品、山奈酚標準品、丁香酚標準品、紫蘇醛標準品、胡椒堿標準品、反式茴香腦標準品、莽草酸標準品、桉油精標準品、阿魏酸標準品14種香辛料主效成分的標準品溶液，每種標準品溶液進樣20 μL，按1.3.1的色譜條件測定，得到標準品高效液相測定色譜圖，見圖1。

圖1 14種主效成分標準品高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of 14 main effective components

注：各圖分別為辣椒素與二氫辣椒素(a)、桂皮醛(b)、橙皮苷(c)、胡椒堿(d)、丁香酚(e)、β-山椒素(f)、山奈酚(g)、歐前胡素(h)、反式茴香腦(i)、莽草酸(j)、桉油精(k)、阿魏酸(l)、紫蘇醛(m)。

由圖1可知，各香辛料主效成分辣椒素、二氫辣椒素、桂皮醛、橙皮苷、胡椒堿、丁香酚、β-山椒素、山奈酚、歐前胡素、反式茴香腦、莽草酸、桉油精、阿魏酸、紫蘇醛標準品的保留時間分別為12.875，19.597，16.327，6.038，21.092，5.036，10.086，15.134，6.141，7.542，3.425，5.132，4.823，7.560 min，且各標準品色譜峰峰形較好。

2.2 15種香辛料提取液中主效成分檢測方法研究

分別精密吸取15種香辛料提取液各20 μL，按1.3.1的色譜條件測定，經(jīng)測定除八角提取液中莽草酸、香葉和草果提取液中桉油精、當歸提取液中阿魏酸這4種香辛料提取液中3種主效成分，由于提取液中其他成分干擾分離效果較差外，其余11種香辛料提取液中的11種有效成分目標峰與其他組分峰能夠良好地分離，其主效成分色譜圖見圖2。

圖2 11種香辛料提取液高效液相色譜色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of 11 spices extracting solution

注：各圖分別為辣椒提取液(a)、桂皮提取液(b)、陳皮提取液(c)、胡椒提取液(d)、丁香提取液(e)、花椒提取液(f)、砂姜提取液(g)、白芷提取液(h)、小茴香提取液(i)、紫蘇提取液(j)、肉豆蔻提取液(k)。

由圖2可知，11種香辛料提取液中的11種主效成分的保留時間分別為：(1)辣椒提取液中辣椒素和二氫辣椒素的保留時間分別是12.679，19.330 min；(2)桂皮提取液中桂皮醛的保留時間是16.338 min；(3)黑胡椒提取液中胡椒堿的保留時間是20.946 min；(4)陳皮提取液中橙皮苷的保留時間是6.045 min；(5)丁香提取液中丁香酚的保留時間是5.008 min；(6)花椒提取液中β-山椒素的保留時間是10.156 min；(7)砂姜提取液中山奈酚的保留時間是15.156 min；(8)白芷提取液中歐前胡素的保留時間是6.158 min；(9)紫蘇提取液中紫蘇醛的保留時間是7.522 min；(10)小茴香提取液中反式茴香腦的保留時間是7.510 min；(11)肉豆蔻提取液中丁香酚的保留時間是5.034 min。上述主效成分保留時間均與圖1對應(yīng)標準品保留時間一致，且分離效果良好。

2.3 標準曲線繪制及香辛料提取液中主效成分含量檢測

2.3.1 標準曲線的繪制

依據(jù)辣椒、花椒、桂皮、陳皮、白芷、砂姜、丁香、紫蘇、黑胡椒、小茴香、肉豆蔻11種香辛料中主效成分檢測方法，精確吸取辣椒素、二氫辣椒素、β-山椒素、桂皮醛、橙皮苷、歐前胡素、山奈酚、丁香酚、紫蘇醛、胡椒堿和反式茴香腦不同濃度梯度的標準品溶液，分別進樣20 μL。按照1.3.1的液相條件進行檢測，以標準品濃度作為橫坐標，峰面積作為縱坐標，分別得到辣椒素、二氫辣椒素、β-山椒素、桂皮醛、橙皮苷、歐前胡素、山奈酚、丁香酚、紫蘇醛、胡椒堿和反式茴香腦11種香辛料主效物質(zhì)的標準曲線、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、濃度范圍，見表1。

表1 11種常見香辛料中主效成分的線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢測濃度范圍Table 1 Linear equations,correlation coefficients and concentration ranges of main effective components in 11 common spices

2.3.2 香辛料提取液中主效成分含量測定

取同一批次的香辛料干粉，按照1.3.2中樣品溶液的提取方法進行制備，過0.45 μm有機濾膜進行色譜分析重復(fù)進樣3次，做3個平行。取峰面積代入曲線方程，得到每種香辛料提取液的主效成分含量,見表2。

表2 11種常見香辛料提取液中主效成分含量Table 2 The main effective components in 11 common spices extracting solution

2.4 傳統(tǒng)鹵水中香辛料主效成分檢測結(jié)果

按照1.3.4方法處理傳統(tǒng)鹵水，采用1.3.1中方法對傳統(tǒng)鹵水中香辛料主效成分進行色譜分析。經(jīng)測定得到辣椒素、胡椒堿、β-山椒素、橙皮苷4種主效成分的含量分別為0.060，0.056，0.072，0.037 mg/mL。

3 結(jié)論

采用高效液相色譜法建立了14種香辛料主效成分標準品的測定方法，經(jīng)測定，辣椒素、二氫辣椒素、桂皮醛、胡椒堿、橙皮苷、山奈酚、歐前胡素、丁香酚、β-山椒素、紫蘇醛、反式茴香腦11種香辛料提取液主效成分在高效液相條件下分離效果較好。最終確定11種常見香辛料提取液中主效成分含量及傳統(tǒng)鹵水中4種香辛料主效成分含量。本文通過11種常見香辛料提取液中主效成分測定方法的建立，為香辛料及醬鹵制品中香辛料主效成分標準化方法檢測提供了技術(shù)支撐。

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