郭，白羊，章永壘，李義嘉，黃奮飛，陳勝亮，王明灶，陳星

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HPLC法快速檢測(cè)重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子原液中醋酸殘留量

361009 廈門(mén)，未名生物醫(yī)藥有限公司

神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor，NGF）是最早發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，其在神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、存活和損傷神經(jīng)修復(fù)中起著重要的作用[1]。目前，臨床采用鼠頜下腺提取的 NGF 用于各類神經(jīng)損傷的修復(fù)，療效顯著[2]。由中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO 細(xì)胞）表達(dá)的重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子（rhNGF）相較于鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子（mNGF）具有活性更高、免疫風(fēng)險(xiǎn)更低的特點(diǎn)，具有廣闊的市場(chǎng)前景[3]。

CHO 細(xì)胞屬于外源細(xì)胞，其重組表達(dá)的蛋白、單克隆抗體等生物制品中可能會(huì)出現(xiàn)病毒污染，采用適宜的手段（如低 pH 孵育法）進(jìn)行病毒滅活能有效提高生物制品的安全性[4]。在 CHO 細(xì)胞重組表達(dá) rhNGF 工藝中，使用醋酸調(diào)節(jié) pH 進(jìn)行病毒滅活，再進(jìn)一步超濾即得 rhNGF 原液。但醋酸屬于國(guó)際人用藥品注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）規(guī)定的第三類溶劑，需要對(duì)產(chǎn)品中醋酸殘留量進(jìn)行檢測(cè)[5]。高效液相色譜（HPLC）法是藥品檢測(cè)中應(yīng)用最為廣泛的檢測(cè)方法，但目前尚無(wú) HPLC 法檢測(cè)生物制品中醋酸含量的報(bào)道。本研究提供了一種能快速檢測(cè)醋酸含量的 HPLC 方法，以檢測(cè) rhNGF 原液中的醋酸殘留量，為 rhNGF 的研發(fā)與生產(chǎn)提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

Waters e2695 HPLC 儀、Waters 2998 PAD 檢測(cè)器、Empower 3 色譜工作站為美國(guó) Waters 公司產(chǎn)品；十萬(wàn)分之一電子天平為德國(guó) Mettler Toledo公司產(chǎn)品；Milli-Q 純水器為美國(guó) Millipore 公司產(chǎn)品。HP-C18 色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）購(gòu)自美國(guó) Sepax 公司；醋酸對(duì)照品、NaH2PO4均購(gòu)自比利時(shí) Acros Organics 公司，純度 99.8%；色譜級(jí)甲醇購(gòu)自美國(guó) Fisher Chemical 公司；rhNGF 各工藝步驟原液（批次 20170401、20170402、20170403）由未名生物醫(yī)藥有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 HPLC 方法 流動(dòng)相為 10 mmol/L NaH2PO4水溶液（pH 2.98）:甲醇= 95:5，流速 1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng) 210 nm；柱溫 30 ℃；進(jìn)樣量 20 μl。

1.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取醋酸對(duì)照品 25.000 mg，置于 25 ml 量瓶中，以流動(dòng)相溶解，定溶，配制成 1 mg/ml 醋酸對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取上述醋酸對(duì)照品儲(chǔ)備液適量于 25 ml 量瓶中，流動(dòng)相稀釋至刻度，以 0.45 μm 濾膜濾過(guò)，即得不同濃度對(duì)照品溶液。

1.2.3 供試品溶液制備 精密量取 rhNGF 原液制備中使用醋酸的相關(guān)步驟樣品，包括低 pH 孵育前樣品、低 pH 孵育樣品、rhNGF 原液（超濾后樣品），根據(jù)醋酸濃度以流動(dòng)相稀釋，以 0.45 μm 濾膜濾過(guò)，即得相應(yīng)供試品溶液。

1.2.4 精密度試驗(yàn) 精密量取醋酸對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，制備成 0.25 mg/ml 醋酸對(duì)照品溶液重復(fù)樣 6 份，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.2.5 專屬性試驗(yàn) 分別取流動(dòng)相、對(duì)照品溶液（醋酸濃度 0.1 mg/ml）、供試品溶液（rhNGF 原液）、供試品加標(biāo)溶液（醋酸加標(biāo)濃度 0.1 mg/ml），按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，判斷對(duì)測(cè)量是否有干擾。

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備與線性關(guān)系考察 精密量取醋酸對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，制備成 0.01、0.05、0.10、0.25、0.50、1.00 mg/ml 的系列對(duì)照品溶液。按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析測(cè)定，以對(duì)照品濃度（mg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積（）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7 檢測(cè)限及定量限測(cè)定 將對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋后，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，直至噪聲信噪比不低于 10:1，得出定量限；繼續(xù)試驗(yàn)直至信噪比不低于 3:1，得出檢測(cè)限。

1.2.8 回收率試驗(yàn) 分別精密稱取同批 rhNGF 原液適量置于量瓶中，按照限度要求濃度（0.25 mg/ml，0.025%）的 80%、100%、120% 三個(gè)水平分別加入醋酸對(duì)照品儲(chǔ)備液，每個(gè)水平各制備 3 份，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定醋酸含量，計(jì)算回收率和 RSD。

1.2.9 樣品測(cè)定 按“1.2.3”項(xiàng)下分別制備 3 批（20170401、20170402、20170403）的低 pH 孵育前樣品、低 pH 孵育樣品、rhNGF 原液等各工藝步驟供試品溶液，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定 rhNGF 各工藝步驟供試品溶液中醋酸的殘留量。

2 結(jié)果

2.1 精密度試驗(yàn)

平行進(jìn)樣 6 次的醋酸峰面積分別為 169373、169159、167311、167909、167489、167989 mAU?min，均值為 168205 mAU?min，峰面積 RSD = 0.513%（n = 6）。表明本方法精密度良好，符合測(cè)定要求。

2.2 專屬性試驗(yàn)

流動(dòng)相、對(duì)照品溶液、供試品溶液（rhNGF 原液）、供試品加標(biāo)溶液的色譜圖如圖 1 所示，空白溶劑、rhNGF 對(duì)醋酸出峰均無(wú)影響，對(duì)測(cè)定均無(wú)干擾。

2.3 線性關(guān)系考察

對(duì)濃度分別為 0.01、0.05、0.10、0.25、0.50、1.00 mg/ml的系列對(duì)照品溶液進(jìn)行積分，以對(duì)照品濃度（mg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積（）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程= 674578.4378– 440.2440（2= 1.0000）。結(jié)果表明，醋酸濃度0.010 ~ 1.000 mg/ml 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（圖2）。

2.4 檢測(cè)限及定量限測(cè)定

將對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋后，直至噪聲信噪比不低于 10:1，得出定量限為 8.0 μg/ml；繼續(xù)試驗(yàn)直至信噪比不低于 3:1，得出檢測(cè)限為 2.0 μg/ml。

2.5 回收率試驗(yàn)

醋酸回收率試驗(yàn)結(jié)果如表 1。80%、100%、120% 三個(gè)水平的回收率分別為101.667、101.111、100.741，RSD 分別為 0.820%、0.381%、0.318%，平均回收率為 101.173%，RSD 為 0.506%，符合檢測(cè)要求。

2.6 樣品測(cè)定

低 pH 孵育前樣品、低 pH 孵育樣品、rhNGF 原液（超濾后樣品）等各工藝步驟供試品檢測(cè)圖譜見(jiàn)圖 3。3 批工藝中低 pH 孵育前樣品均未檢出醋酸，而低 pH 孵育樣品、rhNGF 原液有檢出醋酸，結(jié)果見(jiàn)表 2。3 批 rhNGF 原液中醋酸殘留量分別為 0.086、0.068、0.058 mg/ml，低于醋酸殘留限度 0.25 mg/ml（0.025%）。一步超濾對(duì)醋酸的去除率高達(dá) 99.474%、99.598%、99.654%（平均 99.576%），可以確保 rhNGF 原液中醋酸合格。

圖 1 專屬性試驗(yàn)色譜圖（A：流動(dòng)相；B：對(duì)照品溶液；C：供試品溶液；D：供試品加標(biāo)溶液；1：醋酸峰）

圖 2 醋酸濃度與峰面積相關(guān)性回歸曲線

表 1 醋酸回收率試驗(yàn)結(jié)果

圖 3 各工藝步驟供試品色譜圖[A：流動(dòng)相；B：低 pH 孵育前樣品；C：低 pH孵育樣品（稀釋 20 倍）；D：rhNGF 原液（超濾后）；1：醋酸峰]

3 討論

CHO 細(xì)胞屬于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，與其他表達(dá)系統(tǒng)相比，CHO 表達(dá)系統(tǒng)具有準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能，表達(dá)的蛋白在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近于天然蛋白分子，其在重組蛋白、單克隆抗體表達(dá)發(fā)明的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛[6]。但 CHO 細(xì)胞來(lái)源于中國(guó)倉(cāng)鼠，細(xì)胞本身和生產(chǎn)工藝導(dǎo)致產(chǎn)品出現(xiàn)病毒污染的可能性[7]。因此，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）要求在生產(chǎn)工藝中必須加入經(jīng)驗(yàn)證的病毒滅活步驟，以此排除可能污染的感染性活病毒，有效控制制品的病毒安全性[8]。

低 pH 孵育是常用的病毒滅活手段，其使用方便、工藝穩(wěn)定可靠，且無(wú)病毒滅活劑（如辛酸鈉、磷酸三丁酯等）殘留的問(wèn)題，因此常與柱層析工藝聯(lián)合應(yīng)用在病毒滅活/去除中[4, 9]。醋酸酸性較弱，反應(yīng)較溫和，是目前低 pH 孵育中使用較多的酸類，如在 CHO 細(xì)胞表達(dá)的 rhNGF 工藝中使用醋酸調(diào)節(jié) pH 進(jìn)行病毒滅活，再以磷酸緩沖液進(jìn)行超濾置換，即得 rhNGF 原液。

醋酸是 ICH 規(guī)定的第三類溶劑，急性毒性或短期毒性試驗(yàn)表明這類溶劑幾乎無(wú)毒、無(wú)遺傳毒性，其允許的日接觸量（PDE）為 50 mg 或以上，ICH Q3c 和中國(guó)藥典 2015 年版《通則 0861：殘留溶劑測(cè)定法》規(guī)定其限度為 0.5%[5, 10]。一般來(lái)說(shuō)，僅需要對(duì)在終產(chǎn)品精制過(guò)程中使用的第三類溶劑進(jìn)行殘留量研究，但在新藥的研發(fā)過(guò)程中，有必要對(duì)所有使用到的有機(jī)溶劑進(jìn)行溶劑殘留水平的合理性論證，使藥品的安全性得到最大保證[10-11]。

目前，化學(xué)藥物中醋酸殘留檢測(cè)主要針對(duì)原料藥，如胸腺五肽的醋酸限度為0.5%[12]，而生物制品則尚未有具體參照。中國(guó)藥典 2015 年版三部《人血白蛋白》各論中對(duì)同屬于第三類溶劑的乙醇規(guī)定為人血白蛋白原液中乙醇?xì)埩袅肯薅葢?yīng)不高于 0.025%，遠(yuǎn)低于 0.5% 的常規(guī)乙醇?xì)埩袅肯薅葮?biāo)準(zhǔn)[13]。為最大程度保證藥物的安全性，本研究參照上例嚴(yán)格限定 rhNGF 原液中的醋酸殘留量，將標(biāo)準(zhǔn)定為醋酸殘留量限度應(yīng)不高于 0.025%（0.25 mg/ml）。

前期研究表明，醋酸殘留量檢測(cè)多采用毛細(xì)管氣相色譜法[11, 14]、離子色譜法[15]、HPLC 法[16]，其中氣相色譜法 FID 檢測(cè)器對(duì)醋酸響應(yīng)值低于其他有機(jī)試劑，且檢測(cè)結(jié)果易受氣流穩(wěn)定性影響，重現(xiàn)性不佳；離子色譜法檢測(cè)醋酸近年來(lái)多有報(bào)道，但其對(duì)儀器要求較高，且電導(dǎo)檢測(cè)器通用性較差，導(dǎo)致其在藥企配置率不高，推廣應(yīng)用受到限制；而 HPLC 法操作簡(jiǎn)單，分析速度快，通用性強(qiáng)，是目前藥企配置的最基本檢測(cè)儀器之一，建立適用的 HPLC 法檢測(cè)生物制品原液中醋酸殘留量是十分必要且有推廣意義的。

因此，本研究采用 C18 反相色譜柱，建立以 10 mmol/L NaH2PO4水溶液-甲醇作為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫的 HPLC 快速檢測(cè)方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本方法精密度、專屬性、線性良好，定量限和檢測(cè)限低，回收率符合規(guī)定，適用于 rhNGF 原液中醋酸殘留檢測(cè)；低 pH 值孵育后進(jìn)行一步超濾的 rhNGF 原液中醋酸殘留量為 0.058 ~ 0.082 mg/ml，低于醋酸殘留限度 0.25 mg/ml（0.025%），一步超濾對(duì)醋酸的去除率高達(dá) 99.576%，可以確保 rhNGF 原液中醋酸殘留量符合規(guī)定。本方法的建立為加快 rhNGF 的工業(yè)化生產(chǎn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并可推廣至輔料中不含冰醋酸、醋酸鈉的各類生物制品原液中醋酸殘留量的檢測(cè)，為生物制品新藥研發(fā)提供理論參考。

表 2 各工藝步驟醋酸含量

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國(guó)家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)（2011ZX09401-017）

陳星，Email：amable24@163.com

2017-12-12

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.03.014