王靜，吳嬋，周睿，岑山，徐斌

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乙酰肝素酶對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及血管活性因子表達(dá)的影響

王靜，吳嬋，周睿，岑山，徐斌

100050 北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所免疫室（王靜、周睿、岑山）；100038 北京，首都醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)?fù)興醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（吳嬋、徐斌）

檢測(cè)乙酰肝素酶（HPA）過(guò)表達(dá)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及血管活性因子表達(dá)的影響，進(jìn)一步揭示 HPA 參與調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)血管新生過(guò)程的作用機(jī)制。

構(gòu)建 HPA 基因的過(guò)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染 HUVEC 細(xì)胞。利用 Western blot檢測(cè) HPA 蛋白的過(guò)表達(dá)情況。利用 CCK8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè) HPA 對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響。利用 Western blot 檢測(cè) HPA 對(duì) Ang2 和 Tie2 蛋白表達(dá)的影響。

構(gòu)建的 HPA 表達(dá)載體轉(zhuǎn)染 HUVEC 細(xì)胞后可使 HPA 蛋白水平明顯上調(diào)。隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的增加，HPA 轉(zhuǎn)染組的相對(duì)增殖率可達(dá)對(duì)照組的 2 ~ 3 倍。HPA 轉(zhuǎn)染組的穿膜細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組。HPA 轉(zhuǎn)染組的 Ang2 和 Tie2 的蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組。

HPA 過(guò)表達(dá)可提高 HUVEC 細(xì)胞的增殖和遷移能力，促進(jìn)血管活性分子Ang2 和 Tie2 的表達(dá)，提示 HPA 可能通過(guò)調(diào)控 Ang2/Tie2 的表達(dá)來(lái)影響易損斑塊內(nèi)病理性血管新生。

乙酰肝素酶； 病理性血管新生； 血管活性分子

缺血性腦卒中具有高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率以及高復(fù)發(fā)率的特點(diǎn)，成為威脅人類(lèi)健康和生命的主要疾病之一[1-2]。動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，As）易損斑塊破裂及其導(dǎo)致栓子脫落引起血栓形成是導(dǎo)致缺血性腦卒中事件的重要病因之一[3-4]，因此斑塊穩(wěn)定性問(wèn)題越來(lái)越引起人們的重視。病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，斑塊內(nèi)病理性血管新生的存在和程度與斑塊破裂及臨床腦血管事件相關(guān)[5]。斑塊內(nèi)病理性新生血管的增多，導(dǎo)致斑塊內(nèi)出血風(fēng)險(xiǎn)增加，高危易損斑塊形成，進(jìn)而引起斑塊內(nèi)不穩(wěn)定事件鏈循環(huán)往復(fù)。G?ssl 等[6]發(fā)現(xiàn)，尸解冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊可見(jiàn)大量新生血管形成。對(duì)人類(lèi)進(jìn)展期動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的研究證明血管新生與易損斑塊之間存在明顯的相關(guān)性[7]。綜上所述，病理性血管新生在易損斑塊的發(fā)展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

乙酰肝素酶（heparanase，HPA）是哺乳動(dòng)物體內(nèi)唯一能夠降解細(xì)胞表面及細(xì)胞外基質(zhì)中硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPGs）的 β-D-葡糖醛酸內(nèi)切酶[8-9]。As 易損斑塊形成和進(jìn)展過(guò)程中的具體作用機(jī)制非常復(fù)雜，目前研究顯示 HPA 可通過(guò)促進(jìn)斑塊內(nèi)炎性反應(yīng)、與蛋白水解酶協(xié)同作用以及參與血液高凝狀態(tài)等參與易損斑塊形成[10]。腫瘤學(xué)研究表明，HPA 可通過(guò)降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，釋放和活化血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）及血管生成素（Ang）等多種血管生長(zhǎng)因子，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)血管新生[11-12]。但目前關(guān)于 HPA 參與調(diào)節(jié) As 斑塊內(nèi)血管新生過(guò)程的具體作用機(jī)制尚不清楚。

研究表明，HPA 主要表達(dá)于As 斑塊中的巨噬細(xì)胞，且與斑塊內(nèi)病理性血管新生有著密切聯(lián)系[13-14]。鑒于在腫瘤學(xué)研究中，HPA 通過(guò)釋放血管活性因子參與腫瘤血管新生[15-16]，Ang 家族成員可作用于特異受體酪氨酸激酶受體 2（Tie2），參與腫瘤新生血管的形成、延續(xù)，影響腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移[17-18]。同時(shí)，我們前期研究顯示，與正常動(dòng)脈段相比，As 斑塊內(nèi) HPA 表達(dá)及新生血管形成均增多，且 HPA 表達(dá)與病理性血管新生密切相關(guān)[19-20]。As 斑塊內(nèi) Tie2 表達(dá)增高，且與病理性血管新生呈正相關(guān)。我們推測(cè)，HPA 可能通過(guò) Ang/Tie2 通路參與調(diào)節(jié) As 易損斑塊內(nèi)的血管新生。因此，為了進(jìn)一步探討 As 斑塊內(nèi) HPA 在病理性血管新生過(guò)程中的作用機(jī)制，本文將通過(guò)在血管內(nèi)皮細(xì)胞中上調(diào) HPA 基因的表達(dá)，研究其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及多種血管活性因子表達(dá)的影響，并期望能為全面理解 HPA 在調(diào)控血管新生及尋找干預(yù) As 易損斑塊形成和發(fā)展的新靶點(diǎn)提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和質(zhì)粒 HEK293T 細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室自有；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC 由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院惠贈(zèng)；人源HPA 基因表達(dá)質(zhì)粒通過(guò) PCR 擴(kuò)增、酶切后連接到 pTT3 真核表達(dá)載體獲得。

1.1.2 試劑與儀器 DMEM、含 EDTA 的 0.25% 胰酶、FBS 及Neon 轉(zhuǎn)染系統(tǒng)試劑盒購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司；甲醛和結(jié)晶紫為本室自有；CCK8 活性測(cè)定試劑盒及細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司；細(xì)胞裂解液購(gòu)自美國(guó) Promega 公司；HPA 抗體、Tie2 抗體、Ang2 抗體及 β-actin 抗體購(gòu)自英國(guó) Abcam 公司；辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠二抗和辣根酶標(biāo)記山羊抗兔二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液（ECL）購(gòu)自美國(guó) Millipore 公司。細(xì)胞電轉(zhuǎn)儀 NeonTMTransfection System 購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司；熒光顯微鏡購(gòu)自德國(guó) Carl Zeiss 公司；680 型Microplate Reader 酶標(biāo)儀、PowerPacTMHC Power Supply 蛋白電泳儀、Mini Trans-Blot 蛋白轉(zhuǎn)膜儀及 Gel DocTMXR+ 凝膠成像儀均為美國(guó) Bio-Rad 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 HPA 基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 在 NCBI 中查找人源 HPA 基因（Genbank AF165154.1）的 CDS 序列（1632 bp），利用基因克隆技術(shù)，成功構(gòu)建以 pTT3 為載體骨架的 HPA 基因真核表達(dá)質(zhì)粒 HPA-Bio-His，經(jīng)英駿生物技術(shù)公司測(cè)序鑒定序列正確。

1.2.2 HPA 表達(dá)質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)染HUVEC 細(xì)胞 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 HUVEC 細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，PBS 沖洗 1 次，加入胰酶消化成細(xì)胞懸液，細(xì)胞懸液以800 r/min 離心5 min，棄上清，用 PBS 洗滌一次，離心棄上清，調(diào)整細(xì)胞密度為5 × 107個(gè)/ml。電穿孔方法轉(zhuǎn)染采用 Invitrogen NeonTMTransfection System 進(jìn)行，操作方法參見(jiàn)其使用手冊(cè)，其中電轉(zhuǎn)儀參數(shù)設(shè)置為 1100 V，30 ms，2 個(gè)電脈沖。

1.2.3 CCK8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取生長(zhǎng)良好的HUVEC 細(xì)胞進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于 96 孔板（密度約為 5 × 107個(gè)/ml），設(shè)立實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染 HPA 質(zhì)粒）、對(duì)照組（轉(zhuǎn)染空載體）、空白組（不加細(xì)胞，只含培養(yǎng)液）、陰性對(duì)照組（只含細(xì)胞），每組設(shè) 8 個(gè)復(fù)孔。檢測(cè)時(shí)，細(xì)胞上清更換為含有 10% CCK8 試劑的細(xì)胞培養(yǎng)液，細(xì)胞在 37 ℃、5% 二氧化碳孵箱中繼續(xù)培養(yǎng) 1 h，使用 EnSpire 2300 多功能酶標(biāo)儀檢測(cè) 450 nm 處光吸收。

1.2.4 Transwell 體外遷移實(shí)驗(yàn) 選用 8.0 μm孔徑的 transwell 小室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 HUVEC 細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，PBS 沖洗 1 次，加入胰酶消化成細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞數(shù)為 5 ×107個(gè)/ml 進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。設(shè)立實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組，分別電轉(zhuǎn)染 500 ng 空載體和 HPA 質(zhì)粒。將 100 μl電轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞懸液加入 transwell 上室。然后取含有 20% FBS 的 DMEM 培養(yǎng)基500 μl加入下室。5% 二氧化碳培養(yǎng)箱 37 ℃正常培養(yǎng) 48 h。棉簽擦去上室膜內(nèi)細(xì)胞，甲醛固定20 min；0.5% 結(jié)晶紫室溫染色 10 min，雙蒸水漂洗至多余顏色除去。Transwell 小室置于顯微鏡下觀察膜下表面細(xì)胞，以膜下細(xì)胞的數(shù)量表示遷移能力，隨機(jī)選取視野拍照并計(jì)數(shù)。

1.2.5 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)情況 HEK293T 細(xì)胞和 HUVEC 細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染 500 ng 空載體和 HPA 質(zhì)粒，48 h 后用 80 μl RIPA 細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，旋渦振蕩后再加入 20 μl 5 × 蛋白上樣緩沖液裂解細(xì)胞。金屬浴 100 ℃加熱 40 min。取等量總蛋白進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳，使用 PVDF 膜 70 V 恒壓濕法轉(zhuǎn)膜 1 h 后，5% 脫脂牛奶室溫封閉 1 h。先后與一抗和二抗孵育，最后 ECL 顯色。Western blot 條帶利用 Image J 軟件進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 HPA 基因質(zhì)粒的表達(dá)檢測(cè)

在 HUVEC 細(xì)胞中電穿孔轉(zhuǎn)染 HPA-Bio-His 表達(dá)質(zhì)?；蚩蛰d體，48 h后收取細(xì)胞，提取總蛋白，利用Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè) HPA 的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與空載體的對(duì)照組相比，HPA-Bio-His 表達(dá)質(zhì)粒能夠在 HUVEC 細(xì)胞中正確表達(dá)（圖 1A），且 Western blot 條帶的定量分析結(jié)果顯示， HPA-Bio-His 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后可使 HPA 蛋白表達(dá)量提高 1.5 以上（圖 1B），可用于后續(xù) HPA 過(guò)表達(dá)相關(guān)實(shí)驗(yàn)的研究。

圖 1 HPA 在 HUVEC 細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)情況（A：HPA 蛋白水平；B： Western blot 條帶的定量結(jié)果，**P < 0.01）

Figure 1 Overexpression of HPA in HUVEC cells (A: HPA protein level in HUVEC cells; B: Relative quantification of HPA protein in panel A,**< 0.01)

2.2 HPA 過(guò)表達(dá)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響

在 HUVEC 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染空載體或 HPA 表達(dá)質(zhì)粒，并分別于不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定細(xì)胞活性。結(jié)果顯示，隨著細(xì)胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)天數(shù)的增加，細(xì)胞活性逐漸增強(qiáng)，但 HPA 過(guò)表達(dá)后細(xì)胞的相對(duì)增殖率可達(dá)對(duì)照組的 2 ~ 3 倍（圖 2）。這說(shuō)明過(guò)表達(dá) HPA 可增加 HUVEC 細(xì)胞的增殖能力。

2.3 HPA 過(guò)表達(dá)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響

在 HUVEC 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染空載體或 HPA 表達(dá)質(zhì)粒，48 h 后分別檢測(cè)細(xì)胞的遷移情況。結(jié)果顯示，HPA 過(guò)表達(dá)后穿膜細(xì)胞數(shù)高于對(duì)照組（圖 3A）。在顯微鏡下隨機(jī)選擇三個(gè)視野，計(jì)算兩組中遷移細(xì)胞的數(shù)量，并利用雙尾學(xué)生檢驗(yàn)的方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果顯示 HPA 轉(zhuǎn)染組的穿膜細(xì)胞數(shù)是對(duì)照組的 2 倍左右（圖 3B），這表明 HPA 過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn)了 HUVEC 細(xì)胞的遷移能力（α = 0.05，= 0.047）。

圖 2 HPA 過(guò)表達(dá)對(duì) HUVEC 細(xì)胞增殖能力的影響

Figure 2 Effect of HPA overexpression on the proliferation of HUVEC cells

圖 3 HPA 過(guò)表達(dá)對(duì) HUVEC 細(xì)胞遷移的影響（A：空載對(duì)照組和 HPA 轉(zhuǎn)染組 HUVEC 細(xì)胞遷移情況；B：3 個(gè)隨機(jī)視野下細(xì)胞遷移數(shù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，*P < 0.05）

Figure 3 Effect of HPA overexpression on the migration of HUVEC cells (A: The migration of HUVEC cells transfected with or without HPA plasmid; B: The amounts of cells from three random selected fields,*< 0.05)

圖 4 HPA 過(guò)表達(dá)對(duì) Tie2 和 Ang2 蛋白水平的影響（A：HEK293T 細(xì)胞中Tie2 和 Ang2 的蛋白水平；B：A 圖 Western blot 條帶的定量結(jié)果；C：HUVEC 細(xì)胞中 Tie2 和 Ang2 的蛋白水平；B：C 圖 Western blot 條帶的定量結(jié)果；*P < 0.05，**P < 0.01）

Figure 4 Effect of HPA overexpression on the levels of Tie2 and Ang2 in HEK293T and HUVEC cells (A: Tie2 and Ang2 protein levels in HEK293T cells; B: Relative quantification of each protein in panel A; C: Tie2 and Ang2 protein levels in HUVEC cells; D: Relative quantification of each protein in panel C;*< 0.05,**< 0.01)

2.4 HPA 過(guò)表達(dá)對(duì)血管活性分子表達(dá)的影響

分別在HEK293T 和 HUVEC 細(xì)胞中過(guò)表達(dá) HPA，并檢測(cè)其對(duì) Ang2 及 Tie2 蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，在這兩種細(xì)胞中，HPA 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中內(nèi)源 Tie2 和 Ang2 的蛋白水平均高于對(duì)照組（圖 4A 和 C）。經(jīng) Western blot 條帶的定量分析，顯示 HPA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞后可使 Tie2 和 Ang2 蛋白表達(dá)量提高 1.5 以上（圖 4B和 D），這表明 HPA 過(guò)表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)血管活性分子 Tie2 和 Ang2 的表達(dá)。

3 討論

As 易損斑塊破裂是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過(guò)程，病理性血管新生在 As 斑塊進(jìn)展過(guò)程中起著重要作用。我們前期研究顯示，HPA 在As 斑塊內(nèi)高表達(dá)，且可能促進(jìn)斑塊內(nèi)病理性血管新生過(guò)程，而目前關(guān)于 HPA 與新生血管的關(guān)系研究多集中于腫瘤學(xué)領(lǐng)域。因此，為了明確 HPA 在 As 斑塊內(nèi)血管新生中的作用機(jī)制，本文從細(xì)胞和分子水平進(jìn)一步研究了 HPA 基因?qū)π律艿挠绊憽?/p>

本研究在對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞 HUVEC 的生物學(xué)行為進(jìn)行了一系列研究后發(fā)現(xiàn)，HPA 過(guò)表達(dá)的血管內(nèi)皮細(xì)胞具有較高的增殖率和穿膜能力，說(shuō)明 HPA 與血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)，這與其在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移方面的功能很相似[21]，該結(jié)果揭示了 HPA 在血管新生中具有重要功能。

血管生成素家族及其酪氨酸激酶受體 Tie1 和 Tie2 可以連通內(nèi)皮細(xì)胞和周?chē)g質(zhì)，建立相對(duì)穩(wěn)定的細(xì)胞生化作用[22]。Tie2 具有促進(jìn)血管新生及維護(hù)血管的雙重作用。Ang1 和 Ang2 是 Tie2 特異性配體，它們可以分別激活或轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞 Tie2 信號(hào)。其中 Ang2 可以通過(guò)誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞/周細(xì)胞丟失來(lái)增加內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)促血管新生因子的敏感性，進(jìn)而使新形成的血管系統(tǒng)不穩(wěn)定。本研究發(fā)現(xiàn)，HPA 過(guò)表達(dá)可以促進(jìn) Ang2 和 Tie2 等血管活性因子的表達(dá)。這提示 HPA 還可能通過(guò) Ang2/Tie2 通路參與調(diào)節(jié) As 斑塊內(nèi)的血管新生，但仍需要進(jìn)一步設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，如干擾細(xì)胞 Ang2 或 Tie2 情況下檢測(cè) HPA 對(duì)血管新生的影響等來(lái)完善地證實(shí)這一結(jié)論。

綜上所述，本文從上調(diào) HPA 基因表達(dá)水平角度出發(fā)，證明了HPA與血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移能力密切相關(guān)，同時(shí)促進(jìn) Ang2 及 Tie2 血管活性分子的表達(dá)水平。硫酸甘露糖戊糖硫酸鹽（PI-88）可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制 HPA 表達(dá)，且動(dòng)物模型已證實(shí)PI-88可抑制血管新生[23-24]。我們后續(xù)將利用 HPA 抑制劑 PI-88 從抑制 HPA 表達(dá)角度來(lái)進(jìn)一步完善該工作。本部分工作將為探索 HPA 在 As 易損斑塊內(nèi)血管新生過(guò)程中的作用機(jī)制提供重要的理論依據(jù)，同時(shí)對(duì)促進(jìn) As 治療的藥物新靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)具有重要的指導(dǎo)意義。

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Effects of HPA overexpression on the proliferation, invasion and vasoactive factors levels in HUVEC cell line

WANG Jing, WU Chan, ZHOU Rui, CEN Shan, XU Bin

Author Affiliations: Department of Immunology, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China (WANG Jing, ZHOU Rui, CEN Shan); Department of Neurology (WU Chan, XU Bin), Fuxing Hospital, Capital Medical University, Beijing 100038, China

To explore the effects of HPA overexpression on the proliferation, invasion and vasoactive factors levels in HUVEC cell line and to further reveal the mechanism of HPA involved in the regulation of angiogenesis.

The expression plasmid of human HPA gene was constructed and transfected into HUVEV cells. The overexpression efficiency of the HPA plasmid was assessed by Western blot. Cell counting kit (CCK8) was performed to determine the cell growth and the transwell migration assay was performed to detect the cell migration. The effects of HPA overexpression on Ang2 and Tie2 protein were assessed by Western blot.

HPA expression was significantly upregulated in HUVEC cells transfected with the HPA expression plasmid. With the increase of days post-transfection, the relative cell growth rate in the HPA-transfected group was 2-3 folds more than that in the control group. Moreover, the transmembrane cell number and the protein levels of Ang2 and Tie2 were increased in HPA-transfected group.

HPA overexpressionpromotes HUVEC cell proliferation and migration and enhances the expression of Ang2 and Tie2, indicating that HPA may affect the angiogenesis in vulnerable plaques through regulating Ang2 and Tie2 expression.

Heparanase; Angiogenesis; Vasoactive factors

XU Bin, Email: xubincj1992@aliyun.com

北京市自然科學(xué)基金市教委科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（KZ2015 10025031）

徐斌，Email：xubincj1992@aliyun.com

2018-02-27

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.03.004