趙京鳳，成鐘，王楠，任吉霞，趙曉宏，蔡大勇，謝勇

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小G蛋白ARL8B是潛在的抗原發(fā)性胃低化黏液樣腺癌的藥物作用靶標(biāo)

趙京鳳，成鐘，王楠，任吉霞，趙曉宏，蔡大勇，謝勇

100193 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（趙京鳳、王楠、趙曉宏、蔡大勇、謝勇）；030001 太原，山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（成鐘）；252059 山東，聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（任吉霞）

發(fā)現(xiàn)更多表達(dá)小 G 蛋白 ARL8B 而 ARL8A 無表達(dá)的腫瘤細(xì)胞系，以擴(kuò)大 ARL8B 在抗腫瘤藥物研究中的應(yīng)用范圍。

利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 法測定一些腫瘤細(xì)胞系中的 ARL8B/ARL8A 的相對表達(dá)量；以 ARL8A 和 ARL8B 都表達(dá)的細(xì)胞系作對照，對新發(fā)現(xiàn)的只表達(dá) ARL8B 的腫瘤細(xì)胞系實(shí)施 siRNA 降低 ARL8B 表達(dá)量，用 CCK8 法檢測 ARL8B 表達(dá)量被降低后的細(xì)胞活力變化；用 Western blot 考察 ARL8B 表達(dá)量降低誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的原因。

發(fā)現(xiàn) MGC-803 細(xì)胞表達(dá) ARL8B 而 ARL8A 無表達(dá)，胃癌細(xì)胞系 BGC-823 和MKN-45 均表達(dá) ARL8A 和 ARL8B。ARL8B 被敲低后 MGC-803 細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的凋亡，BGC-823 和 MKN-45 細(xì)胞無明顯的凋亡出現(xiàn)。細(xì)胞自噬水平顯著提高是引起細(xì)胞凋亡的原因。

MGC-803 細(xì)胞系來源于胃低分化黏液樣腺癌患者，是新發(fā)現(xiàn)的表達(dá) ARL8B 而ARL8A 無表達(dá)的腫瘤細(xì)胞系，降低ARL8B 表達(dá)能導(dǎo)致明顯的細(xì)胞凋亡，提示 ARL8B 是抗胃低分化黏液樣腺癌潛在的藥物作用靶標(biāo)。

單體 GTP 結(jié)合蛋白質(zhì)類； ADP 核糖基化因子樣蛋白 8B； 分子靶向治療； 自噬； 原發(fā)性胃低分化黏液樣腺癌

ADP 核糖基化因子樣蛋白 8B（ARL8B）和ARL8A 是結(jié)構(gòu)和功能極其相似的兩個小 G 蛋白[1-2]，具有調(diào)控細(xì)胞自噬增減的功能[3-4]。在全身各個器官內(nèi)這兩個蛋白都有表達(dá)[1]，在極個別的腫瘤細(xì)胞，如前列腺癌細(xì)胞 PPC1 和 DU145 內(nèi)僅有 ARL8B 表達(dá)而無 ARL8A 表達(dá)。對這樣的腫瘤細(xì)胞實(shí)施的異位移植實(shí)驗(yàn)證明，降低 ARL8B 表達(dá)會顯著提升細(xì)胞的自噬水平導(dǎo)致腫瘤消亡，因此 ARL8B 是抗腫瘤藥物作用的靶標(biāo)[5]。迄今為止，ARL8B 作為藥物作用靶標(biāo)僅適用于抗前列腺癌的新藥篩選。為了擴(kuò)大 ARL8B 作為抗腫瘤藥物靶標(biāo)的應(yīng)用范圍，我們利用熒光定量 PCR 法測定一些腫瘤細(xì)胞系內(nèi)的 ARL8B/ARL8A 相對表達(dá)量，對新發(fā)現(xiàn)的表達(dá) ARL8B 而無 ARL8A 的腫瘤細(xì)胞系開展 RNA 干擾法降低 ARL8B 表達(dá)量對細(xì)胞活力的影響研究，以期發(fā)現(xiàn)其他以 ARL8B 為潛在藥物作用靶標(biāo)的腫瘤細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及培養(yǎng)基 HeLa、HepG2、IMR-32、MDA-MB-15、MGC-803、MKN-45、BGC-823、HCCC-9810 和 PC-3 細(xì)胞均來自國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺；MEM 培養(yǎng)基、DMEM 高糖培養(yǎng)基、1640 培養(yǎng)基和 F12 培養(yǎng)基均購自美國 HyClone 公司。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清、青-鏈霉素、細(xì)胞裂解液、蛋白定量試劑、β-actin 兔多克隆抗體、山羊抗兔 IgG (H+L)、HRP 和 ECL 化學(xué)發(fā)光試劑均購自北京博奧龍公司；TRIGene 總 RNA 提取試劑購自美國 GenStar 公司；EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 和 TransStart Top Green qPCR SuperMix 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；0.25% 胰蛋白酶溶液購自美國 HyClone 公司；PVDF 轉(zhuǎn)印膜購自德國Merck Millipore 公司；LipofectamineTM2000 購自美國 Invitrogen 公司；CCK8 試劑盒購自日本同仁公司；ARL8A 兔多克隆抗體和 LC3B 特異性識別多克隆抗體購自美國 Proteintech 公司；KIF2A 多克隆抗體購自美國 Abnova 公司。

1.1.3 主要儀器 電泳儀和 CFX96 實(shí)時(shí) PCR 系統(tǒng)購自美國 Bio-Rad 公司；高速臺式冷凍離心機(jī)購自湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad 公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱和微量紫外分光光度計(jì)購自美國 Thermo 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MGC-803、MKN-45、BGC-823、HCCC-9810、MDA-MB-15 細(xì)胞用 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，HeLa 和 HepG2 細(xì)胞用 DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，IMR-32 細(xì)胞用 MEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，PC3 細(xì)胞用 F-12 培養(yǎng)基培養(yǎng)，每種培養(yǎng)基中添加 10% 胎牛血清、100 IU/ml 青霉素、100 μg/ml 鏈霉素，細(xì)胞靜置于 37 ℃、含 5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度在 80% ~ 90% 時(shí)用 0.25% 胰蛋白酶消化，以 1:3 比例傳代。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 法檢測腫瘤細(xì)胞內(nèi) ARL8A 和 ARL8B 基因的相對表達(dá)量 根據(jù)NCBI 上公布的 ARL8A 和 ARL8B 基因的序列設(shè)計(jì)引物；GAPDH 和 β-actin 引物序列依據(jù)文獻(xiàn)[6-7]由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。ARL8A 正向引物：5' GATCGCTTTGTTCAACA AGC 3'，反向引物：5' GTCCCAGAGCTTGATAGT CACA 3'；ARL8B 正向引物：5' GCTGGCGCTCATC TCC 3'，反向引物：5' GCTTCGAAATCGGGGTT 3'；GAPDH 正向引物：5' GTCCACTGGCGTCTTCAC 3'，反向引物：5' AGGCATTGCTGATGATCTTGA 3'；β-actin 正向引物：5' GGACTTCGAGCAAGAGAT GG 3'，反向引物：5' AGCACTGTGTTGGCGTA CAG 3'。

當(dāng)細(xì)胞的融合度為 80% ~ 90% 時(shí)收集細(xì)胞，應(yīng)用 TRIGene 試劑提取細(xì)胞總 RNA。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒和 1.0 μg 總 RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成 cDNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒采用三步法進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。每種腫瘤細(xì)胞做 3 次生物重復(fù)，每種反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物做 3 次平行測定，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用比較閾值法（2-??CT）進(jìn)行相對定量分析[8]。

1.2.3 siRNA 合成、細(xì)胞轉(zhuǎn)染以及 CCK8 法檢測細(xì)胞活力 用于降低 ARL8B 表達(dá)的siRNA 由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)及合成，合成方法依據(jù)化學(xué)合成寡聚 RNA 方法實(shí)行，合成產(chǎn)物用HPLC 純化，純度大于 99%。合成的 siRNA 序列如下：正義鏈5' CCACCUUCGUCAACGUGAUTT 3'，反義鏈5' AUCACGUUGACGAAGGUGGTT 3'。

將腫瘤細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種到 6 孔板中，分為兩組，分別是對照組和 siRNA 干擾組，每組設(shè) 3 次重復(fù)。對照組為不加轉(zhuǎn)染試劑的正常細(xì)胞，siRNA 干擾組每孔轉(zhuǎn)染試劑配方：15 μl LipofectamineTM2000、15 μl siRNA（20 μmol/L）、500 μl opti-MEM。具體轉(zhuǎn)染方法按照 LipofectamineTM2000 說明書操作，轉(zhuǎn)染 5 h 后換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng) 36 h。

取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，以大約每孔10000 個種于 96 孔板中，每組設(shè)6 個復(fù)孔，分為對照組和 siRNA 干擾組，并設(shè)不含細(xì)胞的空白對照。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行siRNA 轉(zhuǎn)染，siRNA 干擾組每孔轉(zhuǎn)染試劑配方為 0.75 μl LipofectamineTM2000、0.75 μl siRNA（20 μmol/L）、100 μl opti-MEM。siRNA 轉(zhuǎn)染按照 LipofectamineTM2000 說明書操作，轉(zhuǎn)染 5 h 后換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng) 36 h 后加入CCK8 溶液 10 μl，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng) 15 min，使用多功能酶標(biāo)儀檢測 450 nm 波長處的吸光度值（450）并計(jì)算細(xì)胞的生長抑制率，公式為：抑制率（%）=[（對照–干擾）/（對照–空白）]× 100%

1.2.4 Western blot 法檢測蛋白表達(dá)水平 裂解細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白，用 Bradford 法檢測蛋白溶液濃度。取待測樣品 40μg 進(jìn)行 SDS-PAGE，電泳后采用濕轉(zhuǎn)法將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜。用含 5% 脫脂奶粉的 TBST 室溫封閉 2 h 后，加入按配比要求稀釋的一抗溶液，搖床 4 ℃振蕩過夜。用 TBST 緩沖液充分洗去多余的一抗和其他雜質(zhì)后加入二抗溶液，室溫孵育 2 h，再用 TBST 緩沖液洗去多余二抗體后加入 ECL 進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)觀測發(fā)光強(qiáng)度，使用 ImageJ 軟件計(jì)算蛋白質(zhì)的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 腫瘤細(xì)胞內(nèi) ARL8B 和 ARL8A 的相對表達(dá)量

熒光定量 PCR 法測定了 3 種胃癌細(xì)胞 MGC-803、BGC-823 和 MKN-45，及乳腺癌MDA-MB-15 細(xì)胞，前列腺癌 PC3 細(xì)胞，肝癌HepG2 細(xì)胞，膽管癌 HCCC-9810 細(xì)胞，宮頸癌 HeLa 細(xì)胞，神經(jīng)膠質(zhì)瘤 IMR-32 細(xì)胞等 9 種腫瘤細(xì)胞內(nèi) ARL8B、ARL8A、β-actin、GAPDH 基因的 CT 值。以 β-actin 為內(nèi)參，采用 2-??CT法計(jì)算出每種腫瘤細(xì)胞內(nèi) ARL8B 和 ARL8A 對于 GAPDH 的相對表達(dá)量，結(jié)果如圖 1 所示。在這些腫瘤細(xì)胞內(nèi)，ARL8A 和 ARL8B 的表達(dá)量都明顯低于 GAPDH，并且同種細(xì)胞內(nèi) ARL8B 表達(dá)量高于 ARL8A。以 β-actin 為內(nèi)參，采用 2-??CT法計(jì)算出的每種細(xì)胞內(nèi) ARL8B 對于 ARL8A 的相對表達(dá)量，MGC-803：134.65；BGC-823：11.79；MKN-45：9.26；MDA-MB-15：22.41；PC3：10.65；HepG2：6.53；HCCC-9810：5.56；HeLa：4.13；IMR-32：2.72。結(jié)果顯示，胃癌 MGC-803 細(xì)胞內(nèi) ARL8B 和 ARL8A 表達(dá)量懸殊值最大，并且 ARL8A 的表達(dá)量為無檢出狀態(tài)，因此可以認(rèn)為 MGC-803 細(xì)胞表達(dá) ARL8B 而無 ARL8A 表達(dá)，ARL8B 的表達(dá)類型和前列腺癌細(xì)胞 PPC1 和 DU145 相同。

2.2 siRNA 降低 ARL8B 表達(dá)對 3 種胃癌細(xì)胞 MGC-803、BGC-823 和 MKN-45 細(xì)胞活力的影響

如圖 2 所示，siRNA 作用于細(xì)胞 36 h 后，MGC-803 細(xì)胞的生長抑制率是（68.0 ± 1.9）%，BGC-823 細(xì)胞的生長抑制率是（10.9 ± 7.4）%，MKN-45 細(xì)胞的生長抑制率是（0.9 ± 4.6）%；顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，MGC-803 細(xì)胞出現(xiàn)大量死細(xì)胞，而 BGC-823 細(xì)胞和 MKN-45 細(xì)胞生長狀況正常。

2.3 Western blot 檢測 siRNA 干擾 ARL8B 基因后相關(guān)蛋白的表達(dá)水平變化

前列腺癌細(xì)胞 PPC1 或 DU145 內(nèi)降低 ARL8B 表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的原因是 ARL8B 和 ARL8A 都消失能促進(jìn)細(xì)胞自噬，過度降解自身成分最終導(dǎo)致凋亡[5]。為了驗(yàn)證降低 ARL8B 的表達(dá)量誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞 MGC-803 是否也是同樣的原因?qū)е录?xì)胞凋亡，用Western blot 檢測了 MGC-803 細(xì)胞內(nèi) siRNA 抑制 ARL8B 表達(dá)后表征細(xì)胞自噬水平高低的幾個蛋白質(zhì)的相對表達(dá)量變化。結(jié)果如圖 3 顯示，siRNA 作用于細(xì)胞后觀測不到 ARL8B。ARL8A 和 ARL8B 的氨基酸序列相似度為 91%[1]，Western blot 分析使用的 ARL8B 抗體也能識別 ARL8A，如果細(xì)胞內(nèi)有 ARL8A 存在的話，在同樣的位置也能檢測出條帶，這個結(jié)果支持MGC-803 內(nèi) ARL8A 無表達(dá)。如已報(bào)道的 ARL8B誘導(dǎo)細(xì)胞自噬機(jī)制所述，ARL8B 蛋白表達(dá)量降低，KIF2A 表達(dá)量也降低，溶酶體無法遷移到細(xì)胞外圍只能定位到核區(qū)附近，此時(shí) mTORC1 通路被抑制使得細(xì)胞自噬被順利誘導(dǎo)，細(xì)胞長期處于高自噬狀態(tài)最終導(dǎo)致凋亡[3-5]。本項(xiàng)研究中，Western blot 測定結(jié)果顯示 ARL8B 消失伴隨 KIF2 的表達(dá)水平降低，與報(bào)道的 ARL8B 表達(dá)量降低可誘導(dǎo)細(xì)胞結(jié)論一致（圖 3B）。此外觀測到的LC3-II/LC3-I 的數(shù)值明顯增大（圖 3C），表明LC3-I 轉(zhuǎn)換 LC3-II的量增加，標(biāo)志細(xì)胞的自噬體形成增多，細(xì)胞的自噬水平提升[9-10]。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，胃癌 MGC-803 細(xì)胞也是只表達(dá) ARL8B 的腫瘤細(xì)胞，敲低 ARL8B 也能發(fā)生細(xì)胞凋亡，因此，ARL8B 不僅可以作為抗前列腺癌的藥物作用靶標(biāo)，也能作為抗原發(fā)性胃低分化黏液樣腺癌的藥物作用靶標(biāo)，對于 ARL8A 和 ARL8B 都表達(dá)的胃癌或者其他腫瘤細(xì)胞系，僅降低 ARL8B 的表達(dá)量不能誘導(dǎo)明顯的細(xì)胞凋亡，則將 ARL8B 作為抗腫瘤藥物作用靶標(biāo)是不合適的。

圖 1 腫瘤細(xì)胞內(nèi)的 ARL8A 和 ARL8B 相對于該細(xì)胞 GAPDH 的相對表達(dá)量統(tǒng)計(jì)圖（n = 3，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001）

Figure 1 Statistics of the relative expression of ARL8A and ARL8B, compared with GAPDH in the tumor cells (n = 3,*< 0.05,**< 0.01,***< 0.001)

圖 2 siRNA 干擾 ARL8B 基因 36 h 時(shí) MGC-803、BGC-823 和 MKN-45 細(xì)胞的顯微觀察（A）（× 200）和生長抑制率統(tǒng)計(jì)圖（B）（n = 3，和 MGC-803 相比，*P < 0.05，***P < 0.001）

Figure 2 Morphological changes (A) (× 200) and analysis of cell growth inhibition rate (B) of MGC-803, BGC-823 and MKN-45 cells after ARL8B gene knockdown with siRNA for 36 h (n = 3,*< 0.05,***< 0.001 vs MGC-803)

圖 3 Western blot 檢測 siRNA 干擾 ARL8B 基因后相關(guān)蛋白的表達(dá)水平變化[A：MGC-803 細(xì)胞中表征細(xì)胞自噬的幾個主要蛋白的印跡圖；B：對照組和siRNA 干擾組中 ARL8B 和 KIF2A 蛋白相對表達(dá)量（n = 3，*P < 0.05，**P < 0.01）；C：對照組和siRNA 干擾組中 LC3-II/LC3-I 比值（n =3，***P < 0.001）]

Figure 3 Expression of related proteins by Western blot after ARL8B knockdown [A: Blots of several major proteins that characterize autophagy in MGC-803 cells; B: Relative expression of ARL8B and KIF2A proteins in control and siRNA interference groups (n = 3,*< 0.05,**< 0.01); C: LC3-II/LC3-I ratio in control and siRNA interference groups (n = 3,***< 0.001)

3 討論

ARL8A 和 ARL8B 是和溶酶體結(jié)合的小 G 蛋白，是溶酶體運(yùn)動和膜轉(zhuǎn)運(yùn)的重要調(diào)控因子，是調(diào)控溶酶體定位誘導(dǎo)細(xì)胞自噬水平增減的關(guān)鍵蛋白質(zhì)[3, 11-15]，在免疫細(xì)胞內(nèi)抗原呈遞中也發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用[16-17]。自噬是細(xì)胞抵抗饑餓產(chǎn)生的反應(yīng)，對于 ARL8A 和 ARL8B 都存在的細(xì)胞，諸如 HeLa 細(xì)胞，在營養(yǎng)貧乏的環(huán)境中，細(xì)胞靠降解細(xì)胞內(nèi)的成分來提供能量和必要營養(yǎng)物質(zhì)以抵抗饑餓導(dǎo)致的損傷，此時(shí) ARL8A 和 ARL8B 的表達(dá)量都降低，溶酶體遷移至細(xì)胞中部形成自噬溶酶體，細(xì)胞自噬水平增加。當(dāng)細(xì)胞恢復(fù)到營養(yǎng)豐富的環(huán)境中，ARL8A 和 ARL8B 的表達(dá)量都升高，溶酶體遷移至細(xì)胞外圍，不易形成自噬溶酶體，此時(shí)細(xì)胞直接吸收外來營養(yǎng)物質(zhì)維持生命活動，自噬水平降低。又如本項(xiàng)研究中的胃癌 BGC-823 細(xì)胞和 MKN-45 細(xì)胞，它們在營養(yǎng)豐富的環(huán)境中被敲除 ARL8B 時(shí)，由于 ARL8A 依然能讓溶酶體定位在外圍，細(xì)胞內(nèi)不易形成自噬溶酶體，自噬水平不發(fā)生顯著提升，細(xì)胞依然從培養(yǎng)基中攝取營養(yǎng)來維持生命活動，因而細(xì)胞活力無明顯降低。對只表達(dá) ARL8B 的腫瘤細(xì)胞，如前列腺癌細(xì)胞 PPC1、DU145 和本文中的胃癌 MGC-803 細(xì)胞，在營養(yǎng)豐富的環(huán)境中降低 ARL8B 表達(dá)量就能導(dǎo)致明顯的細(xì)胞凋亡。原因是當(dāng) ARL8B 和 ARL8A 都不存在的情況下，溶酶體遷移不受它們的控制，更容易形成自噬溶酶體提升細(xì)胞的自噬水平。相當(dāng)于盡管細(xì)胞處于營養(yǎng)豐富的環(huán)境中卻無法從外界吸收營養(yǎng)，只能降解自身的成分來維持生命活動而導(dǎo)致凋亡[5]。依據(jù)已有的報(bào)道和本項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)的 ARL8B 與 ARL8A 的表達(dá)量對比結(jié)果，腫瘤細(xì)胞系分為 ARL8B 單表達(dá)型、ARL8A 單表達(dá)型和兩者共有型，也許還存在 ARL8A 和 ARL8B 都不表達(dá)的腫瘤細(xì)胞系。迄今為止腫瘤細(xì)胞系或者腫瘤患者的癌組織內(nèi)關(guān)于 ARL8B 與 ARL8A 相對表達(dá)量的研究成果還很缺乏。尚無 ARL8A 單獨(dú)表達(dá)的腫瘤細(xì)胞系的研究報(bào)告，ARL8A 是否也能作為藥物作用靶標(biāo)尚需開展深入研究。既有文獻(xiàn)[4]和本項(xiàng)研究結(jié)果都證實(shí)通過降低 ARL8B 的表達(dá)量誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法僅適用于抗 ARL8B 單表達(dá)型腫瘤的新藥研發(fā)。

人源 ARL8B-GDP 復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)已被測定。為開展靶向 ARL8B 抗腫瘤藥物理性化篩選提供了分子結(jié)構(gòu)證據(jù)。由于 ARL8B 的結(jié)構(gòu)與 ARL8A 極其相似且在全身都有表達(dá)，ARL8B 抑制劑對 ARL8A 也會有很好的抑制效果，直接作用于人體可能會出現(xiàn)很大的毒副作用。而 siRNA 是抑制特定基因表達(dá)的小分子量核酸，如果能利用靶向給藥系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn) ARL8B 的 siRNA 對前列腺癌、原發(fā)性胃低分化黏液樣腺胃癌組織的定點(diǎn)輸送，通過敲低 ARL8B 的表達(dá)量實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤的增殖或擴(kuò)散，則有望成為高效低毒的抗腫瘤藥物。

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A small GTPase ARL8B as a potential drug target for treatment of primary gastric myxoid adenocarcinoma with low differentiation

ZHAO Jing-feng, CHENG Zhong, WANG Nan, REN Ji-xia, ZHAO Xiao-hong, CAI Da-yong, XIE Yong

Author Affiliations: Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education, Department of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100193, China (ZHAO Jing-feng, WANG Nan, ZHAO Xiao-hong, CAI Da-yong, XIE Yong); Department of Biochemistry and Molecular Biology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China (CHENG Zhong); College of Life Science, Liaocheng University, Shandong 252059, China (REN Ji-xia)

To identify more tumor cell lines expressing the small GTPase ARL8B but not ARL8A, and to understand more about the application of ARL8B in antitumor drug research.

Real-time fluorescence quantitative PCR was used to determine the relative expression levels of ARL8B/ARL8A in some tumor cell lines. The tumor cell line expressing ARL8B only were treated with siRNA to reduce ARL8B expression, then CCK8 was used to detect cell viability. The cell lines expressing both ARL8A and ARL8B were used as control. Western blot was used to examine the mechanism for the apoptosis induced by decreased ARL8B.

Gastric cancer cell line MGC-803 was found to solely express ARL8B, while gastric cancer cell lines BGC-823 and MKN-45 expressed both ARL8A and ARL8B. After ARL8B knockdown, more obvious apoptosis was found in MGC-803 cells, than that in BGC-823 and MKN-45 cells. Significant increase of autophagy might be the cause of apoptosis.

The MGC-803 cell line, isolated from primary gastric myxoid adenocarcinoma with low differentiation, is identified to express only ARL8B. Decreasing the expression of ARL8B can lead to significant cell apoptosis, suggesting that ARL8B might be a potential drug target for the treatment of the primary gastric myxoid adenocarcinoma.

Monomeric GTP-binding protein; ADP-ribosylation factor like protein 8B; Molecular targeted therapy; Autophagy; Primary gastric low differentiation myxoid adenocarcinoma

XIE Yong, Email: yxie@implad.ac.cn

國家自然科學(xué)基金（81473114）；教育部“新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃”

謝勇，Email：yxie@implad.ac.cn

2018-01-08

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.03.002