陳文韜 薛耀華 黃進(jìn)梅 楊結(jié)儀 趙云虎 藍(lán)銀苑 方銘恒 鄭碧英 鄭和平

510000廣州，南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院 廣東省皮膚病醫(yī)院檢驗(yàn)科（陳文韜、薛耀華、黃進(jìn)梅、趙云虎、藍(lán)銀苑、方銘恒、鄭和平）；廣東醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院（楊結(jié)儀、鄭碧英）

2008—2015年全國105個性病監(jiān)測點(diǎn)生殖道沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，Ct）感染報告發(fā)病率由2008年的32.48/10萬增長到2015年的37.18/10萬［1］。臨床上10% ～ 15%的患者出現(xiàn)Ct再感染和持續(xù)性感染，成為治療面臨的一大難題［2］。Lewis等［3］在經(jīng)首選藥物阿奇霉素治療的患者中發(fā)現(xiàn)Ct持續(xù)性感染的特征表現(xiàn)——異形包涵體。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，持續(xù)性感染在應(yīng)激因素作用下產(chǎn)生，Ct處于存活但不繁殖狀態(tài)，具有更強(qiáng)的抵抗外界惡劣環(huán)境的能力；當(dāng)應(yīng)激因素去除后，又可恢復(fù)成急性感染，進(jìn)而生長繁殖［4］。目前持續(xù)性感染被認(rèn)為是造成臨床治療失敗的重要原因之一，但其產(chǎn)生的機(jī)制尚不清楚。調(diào)控宿主細(xì)胞凋亡是許多病原體建立感染的重要機(jī)制。研究證明，Ct通過多條途徑抑制宿主細(xì)胞凋亡，以利于其生長繁殖［5-8］。本研究研究阿奇霉素誘導(dǎo)Ct持續(xù)性感染對宿主細(xì)胞凋亡的影響，探討Ct持續(xù)性感染的發(fā)生機(jī)制。

材料與方法

一、主要試劑和細(xì)胞

人宮頸癌細(xì)胞株（Hela229）來自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，D型Ct標(biāo)準(zhǔn)株獲贈于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所，阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)品為廣東省藥品檢驗(yàn)所（純度94.4%）產(chǎn)品，DMEM培養(yǎng)液為美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品，凋亡誘導(dǎo)劑星狀孢子素（staurosporine）為美國 Alexis Biochemicals公司產(chǎn)品，Ct直接免疫熒光檢測試劑盒產(chǎn)于愛爾蘭Trinity Biotech公司，膜聯(lián)蛋白V-碘化丙錠（Annexin V-PI）凋亡檢測試劑盒為美國BD Biosciences公司產(chǎn)品，Hoechst 33258產(chǎn)于廣州GBCBIO Technologies公司。

二、Ct持續(xù)性感染和急性感染細(xì)胞模型的構(gòu)建及驗(yàn)證

待鋪于6/24孔細(xì)胞板（含細(xì)胞爬片）內(nèi)的Hela229細(xì)胞融合率達(dá)到80%時，加入D型Ct標(biāo)準(zhǔn)株，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22 h，將DMEM培養(yǎng)液置換為含有0.08 mg/L阿奇霉素的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，構(gòu)建持續(xù)性感染細(xì)胞模型［9］。在感染22 h時，將DMEM培養(yǎng)液置換為新鮮的DMEM培養(yǎng)液（不含阿奇霉素），繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，構(gòu)建急性感染細(xì)胞模型。分別用免疫熒光和電鏡技術(shù)檢測Ct包涵體的形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)，免疫熒光技術(shù)方法如下：取出24孔板內(nèi)的細(xì)胞爬片，丙酮固定細(xì)胞，磷酸緩沖液（PBS）漂洗，加入異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的抗Ct主要外膜蛋白（MOMP）的熒光抗體，室溫避光孵育15 min，經(jīng)PBS漂洗后加入DAPI染料，室溫避光孵育15 min，PBS漂洗后熒光顯微鏡觀察。電鏡技術(shù)方法如下：用胰蛋白酶將6孔板內(nèi)細(xì)胞消化后離心，用PBS漂洗2次，離心后加入4%戊二醛固定，電鏡檢測。持續(xù)性感染Ct包涵體內(nèi)異形網(wǎng)狀體的存在可認(rèn)為模型構(gòu)建成功。

感染48 h去除含有阿奇霉素的DMEM培養(yǎng)液，PBS充分洗滌3次，置換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至96 h，通過電鏡技術(shù)檢測Ct包涵體，以驗(yàn)證Ct持續(xù)性感染細(xì)胞模型。

三、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

構(gòu)建急性感染和持續(xù)性感染模型，分別在感染24 h和48 h，對兩組細(xì)胞采用1 μmol/L STS處理，4 h后進(jìn)行凋亡檢測。以未感染細(xì)胞為陰性對照，22 h更換新鮮培養(yǎng)液，在相同時間接受STS處理4 h后進(jìn)行凋亡檢測。

用4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，PBS漂洗，加入Hoechst 33258染色15 min，PBS洗滌、封片，熒光顯微鏡下觀察。同時用不含乙二胺四乙酸的胰蛋白酶收集各組細(xì)胞，預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌后，1×結(jié)合緩沖液調(diào)整細(xì)胞為1×106個/ml，同時加入Annexin V-FITC和PI，輕輕混勻并避光孵育15 min，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀分析凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有數(shù)據(jù)均用x±s表示，兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、Ct持續(xù)性感染細(xì)胞模型的建立及驗(yàn)證

Ct感染48 h，免疫熒光染色觀察，Hela229細(xì)胞內(nèi)可見綠色熒光的Ct包涵體，急性感染模式中包涵體體積大（圖1A）；而由0.08 mg/L阿奇霉素誘導(dǎo)的Ct持續(xù)性感染包涵體呈固縮形，體積較急性感染組?。▓D1B）。

電鏡觀察可見，Ct急性感染48 h時包涵體內(nèi)含有大量原體（elementary body，EB）和少量網(wǎng)狀體（reticulate body，RB）（圖2A），而Ct持續(xù)性感染包涵體內(nèi)為畸形網(wǎng)狀體，無EB存在（圖2B）。去除阿奇霉素作用繼續(xù)培養(yǎng)至96 h，Ct持續(xù)性感染包涵體內(nèi)出現(xiàn)EB（圖2C）。

二、Ct急性感染和持續(xù)性感染調(diào)控Hela229細(xì)胞凋亡

圖1 沙眼衣原體包涵體免疫熒光染色（×400） 1A：急性感染；1B：持續(xù)性感染。綠色熒光示沙眼衣原體包涵體

圖2 沙眼衣原體包涵體電鏡檢測 2A：急性感染48 h包涵體；2B：持續(xù)性感染48 h包涵體；2C：持續(xù)性感染去除阿奇霉素后繼續(xù)培養(yǎng)至感染96 h時包涵體。圖中標(biāo)尺=2 μm

感染24 h，STS誘導(dǎo)凋亡4 h后，Hoechst染色發(fā)現(xiàn)，急性感染和持續(xù)性感染組感染Ct的細(xì)胞均未出現(xiàn)凋亡（圖3A、3B），而未感染Ct的細(xì)胞出現(xiàn)不同程度核固縮、碎裂，高亮藍(lán)色凋亡小體（圖3F）。感染48 h經(jīng)STS誘導(dǎo)凋亡后，部分急性感染的細(xì)胞染色質(zhì)呈現(xiàn)一定程度的濃縮（圖3C），持續(xù)性感染的細(xì)胞未見凋亡（圖3D）。未經(jīng)過STS處理的細(xì)胞，染色質(zhì)均勻，未見濃聚（圖3E）。

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果見圖4及表1。急性感染組和持續(xù)性感染組24、48 h時細(xì)胞經(jīng)STS處理4 h后，細(xì)胞凋亡率與未感染組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而急性感染組與持續(xù)性感染組相比，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

討 論

體外研究發(fā)現(xiàn)，Ct在γ干擾素（IFN-γ）、青霉素、鐵缺乏、熱休克和單純皰疹病毒（HSV）共感染等應(yīng)激因素作用下，將進(jìn)入特殊的生長狀態(tài)——持續(xù)性感染，存活但不繁殖，呈異形包涵體；去除應(yīng)激因素后又可恢復(fù)急性感染［10］。該狀態(tài)下，Ct對阿奇霉素耐受性顯著增加［11］。盡管目前阿奇霉素仍是治療Ct的首選藥物，但Meta分析顯示，其治療有效率已有所下降［12-13］。我們使用阿奇霉素作為誘導(dǎo)劑，成功構(gòu)建Ct持續(xù)性感染Hela細(xì)胞模型，并通過去除阿奇霉素作用，使Ct持續(xù)性感染恢復(fù)急性感染，發(fā)現(xiàn)其包涵體內(nèi)重新出現(xiàn)具有感染能力的EB。盡管阿奇霉素與青霉素同為抗生素，但兩者誘導(dǎo)Ct持續(xù)性感染的機(jī)制存在差異。青霉素可在感染早期誘導(dǎo)Ct持續(xù)性感染，而阿奇霉素?zé)o法在Ct感染早期誘導(dǎo)成功，其作用時間在EB向RB轉(zhuǎn)變的重要階段［9-10］。當(dāng)去除阿奇霉素作用后，Ct需要一定時間才能恢復(fù)感染性，說明在阿奇霉素作用下Ct處于存活、無感染性的持續(xù)性感染狀態(tài)［9］。

圖3 Hoechst染色檢測星狀孢子素（STS）誘導(dǎo)Hela229細(xì)胞凋亡（×400） 3A：沙眼衣原體急性感染24 h；3B：沙眼衣原體持續(xù)性感染24 h；3C：沙眼衣原體急性感染48 h；3D：沙眼衣原體持續(xù)性感染48 h；3E：未經(jīng)STS處理的未感染細(xì)胞；3F：經(jīng)STS處理的未感染細(xì)胞。箭頭所示為發(fā)生凋亡的細(xì)胞染色質(zhì)

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測星狀孢子素（STS）處理4 h后Hela229細(xì)胞凋亡率4A：細(xì)胞在沙眼衣原體感染24 h凋亡情況；4B：細(xì)胞在沙眼衣原體感染48 h凋亡情況

細(xì)胞凋亡是宿主抗病原體感染的重要防御機(jī)制，而調(diào)控宿主細(xì)胞凋亡是病原體建立感染并順利生長繁殖的基礎(chǔ)。Ct作為嚴(yán)格胞內(nèi)寄生病原體，通過獲取宿主細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)，調(diào)控宿主細(xì)胞凋亡維持自身穩(wěn)定的生長環(huán)境［5-8］。在持續(xù)性感染狀態(tài)下Ct長期存活而不繁殖，其對宿主細(xì)胞凋亡的調(diào)控，也有利于其在機(jī)體免疫壓力下長期存活。有研究發(fā)現(xiàn)，衣原體對宿主細(xì)胞凋亡調(diào)控具有雙向性，可誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡，也可抑制宿主細(xì)胞凋亡，這一作用不僅與型別和菌株有關(guān)，同樣也與病原體載量有關(guān)［14］。早期研究表明，IFN-γ誘導(dǎo)的 Ct持續(xù)性感染可使細(xì)胞存活至感染120 h［15］。然而，不同應(yīng)激因素引起的Ct持續(xù)性感染，衣原體在轉(zhuǎn)錄水平均存在差異［16］。為探討阿奇霉素誘導(dǎo)Ct持續(xù)性感染對宿主細(xì)胞凋亡的影響，我們在Ct持續(xù)性感染細(xì)胞模型基礎(chǔ)上，通過STS誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡，檢測Ct對宿主細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用。

我們發(fā)現(xiàn)，在感染早期Ct急性感染和由阿奇霉素誘導(dǎo)的持續(xù)性感染均具有抗宿主細(xì)胞凋亡的能力。而在感染晚期，急性感染抵抗宿主細(xì)胞凋亡的能力消失，與Ct完成正常的生長周期后釋放EB感染新的細(xì)胞有關(guān)，這與Ying等［17］的研究結(jié)果相似。由阿奇霉素誘導(dǎo)的Ct持續(xù)性感染，則在感染48 h時仍具有抗宿主細(xì)胞凋亡的作用，這一現(xiàn)象也說明持續(xù)性感染在衣原體免疫逃逸方面具有重要作用，因?yàn)榘l(fā)生凋亡的細(xì)胞可被機(jī)體的吞噬細(xì)胞清除，而衣原體在處于凋亡抵抗的細(xì)胞內(nèi)可長期存活。盡管這一現(xiàn)象與IFN-γ誘導(dǎo)Ct持續(xù)性感染對抗宿主細(xì)胞凋亡作用相似，但兩者調(diào)控機(jī)制和途徑可能不盡相同。

本研究成功構(gòu)建由阿奇霉素誘導(dǎo)Ct持續(xù)性感染的細(xì)胞模型。由于阿奇霉素為臨床一線用藥，該模型將為進(jìn)一步研究Ct持續(xù)性感染的發(fā)生機(jī)制提供有力條件。Ct持續(xù)性感染對宿主細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用，在復(fù)雜的機(jī)體免疫環(huán)境下也可能存在其他機(jī)制，使其長期存活而不被清除。由于機(jī)體免疫的復(fù)雜性，臨床上持續(xù)性感染的產(chǎn)生僅與藥物作用有關(guān)，抑或由于藥物和機(jī)體免疫聯(lián)合作用，有待進(jìn)一步探討。

表1 流式細(xì)胞儀檢測沙眼衣原體（Ct）急性和持續(xù)性感染Hela229細(xì)胞凋亡率（%，x±s）