王佳茜，李俊強(qiáng)，趙凱麗，王磊

祛風(fēng)除濕膏是由血竭、黃芪、當(dāng)歸等十五味中藥組成，具有益氣血，補(bǔ)肝腎，祛風(fēng)濕，活血通絡(luò)的功效，用于治療風(fēng)濕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊椎炎。血竭為傳統(tǒng)名貴中藥，具有活血定痛、化瘀生肌的功效[1]。血竭素是血竭的主要有效成分之一，故本文以血竭素的含量為指標(biāo)，采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）建立了祛風(fēng)除濕膏中血竭素含量的測(cè)定方法，為該制劑的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

島津LC-20AT高效液相液相色譜儀，SPD-20A型控制器；梅特勒托利多AE240電子分析天平；超聲波處理器（昆山市超聲儀器有限公司）。血竭素高氯酸鹽對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110811-201506）；3批祛風(fēng)除濕貼膏樣品（市售)；乙腈、磷酸二氫鈉為色譜純；水為超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Kromasil-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm, 5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.5 moL﹒L-1磷酸二氫鈉溶液（41:59），檢測(cè)波長(zhǎng)440 nm，流速1 mL﹒min-1，色譜柱溫度為25 ℃，進(jìn)樣量20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取血竭素高氯酸鹽對(duì)照品9 mg，精密稱定，置10 mL棕色量瓶中，加3%磷酸甲醇溶液使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得，每1 mL中含血竭素0.654 mg(血竭素重量=血竭素高氯酸鹽重量／1.377)。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密刮取膏藥0.5 g，置于具塞錐形瓶中，加3 %磷酸甲醇溶液50 mL，密塞，精密稱重，75 ℃加熱回流30 min，放冷，甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 取除血竭以外的其他藥材，按確定的制備工藝制備不含血竭的陰性對(duì)照樣品，按照供試品溶液的制法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 含量測(cè)定

2.3.1 專屬性考察 分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液與陰性對(duì)照品溶液，注入液相色譜儀檢測(cè)。結(jié)果表明，其他組分對(duì)血竭素測(cè)定結(jié)果無干擾。結(jié)果見圖1。

圖1 祛風(fēng)除濕膏 HPLC圖

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下血竭素高氯酸鹽對(duì)照品溶液（相當(dāng)于血竭素0.654 mg﹒mL-1）0.1, 0.2，0.4, 0.8, 1 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。得濃度為6.5 μg﹒mL-1、13 μg﹒mL-1、26μg﹒mL-1、52 μg﹒mL-1、65 μg﹒mL-1的對(duì)照品溶液，如法測(cè)定，以血竭素高氯酸鹽峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸分析。結(jié)果回歸方程為Y= 29081X-2534.1，相關(guān)系數(shù)r為0.9995。結(jié)果表明，血竭素濃度在6.5 μg﹒mL-1-65 μg﹒mL-1內(nèi)線性關(guān)系良好。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖2 血竭素高氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液（26 μg﹒mL-1），重復(fù)測(cè)定6次。結(jié)果血竭素高氯酸鹽峰面積積分值RSD=1.6 %，表明方法精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 吸取同一供試品溶液，分別于供試品溶液制備后的0，2，4，6, 8，12，24小時(shí)測(cè)定血竭素峰面積。結(jié)果血竭素峰面積積分值變異系數(shù)RSD=2.1 %，表明供試品溶液在24h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 刮取同一批祛風(fēng)除濕膏的膏藥，共6份，分別制得6份供試品溶液，如法測(cè)定。測(cè)得含量的RSD= 1.23 %，表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收試驗(yàn) 取已知血竭素含量的祛風(fēng)除濕膏膏藥(血竭素含量為1.853 mg﹒g-1)，共6份，每份約0.25 g，精密稱定，分別精密加入血竭素高氯酸鹽對(duì)照品溶液（相當(dāng)于血竭素0.465 mg﹒mL-1）1 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制得供試品溶液。如法測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 血竭素加樣回收試驗(yàn)

2.3.6 樣品含量測(cè)定 取3批樣品，按確定方法測(cè)定血竭素含量，結(jié)果3批樣品每克含血竭素的平均含量分別為1.879 mg﹒g-1、1.876 mg﹒g-1、1.853 mg﹒g-1。

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法優(yōu)選時(shí)，采用3 %磷酸甲醇溶液作為溶劑，可使樣品中的血竭素轉(zhuǎn)變?yōu)檠咚氐牧姿猁}，增強(qiáng)其穩(wěn)定性[2]。同時(shí)比較了3 %磷酸甲醇溶液超聲30 min、60 min，加熱回流30 min、60 min，結(jié)果表明加熱回流30 min時(shí)，可較好的提取樣品中的血竭素。

3.2 色譜條件優(yōu)選時(shí)，參考已有文獻(xiàn)[3-5]，試驗(yàn)了乙腈-0.5 mol﹒L-1磷酸二氫鈉溶液（50:50, 45:50, 35:50）等不同的流動(dòng)相比例，結(jié)果顯示當(dāng)比例為35:50時(shí)，目標(biāo)峰分離度良好。為了縮短分析時(shí)間，最終確定流動(dòng)相為乙腈-0.5 mol﹒L-1磷酸二氫鈉溶液（41:59）。

[1]陳軍霞,邱碧菡,潘林梅，等.血竭的現(xiàn)代研究[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐,2011,03:81.

[2]竇金鳳,曹云飛.HPLC測(cè)定活血壯筋丸中血竭素的含量[J].現(xiàn)代儀器,2009,02:32.

[3]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].2015:142

[4]譚生建,賀業(yè)謙,梁愛君,等.HPLC測(cè)定通絡(luò)止痛散中血竭素的含量[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào),2012,06:514.

[5]蔡穎.HPLC測(cè)定龍血竭膠囊中血竭素的含量[J].藥學(xué)進(jìn)展,2004,08:376.