董青松 譚偉東 鐘一雄 朱艷霞 李琴 何俊兵 柯芳

摘要?[目的]為規(guī)范中藥材種子市場，保證種子的質(zhì)量，研究制定毛雞骨草種子檢驗(yàn)規(guī)程。[方法]參照現(xiàn)有種子質(zhì)量檢驗(yàn)的成果，研究毛雞骨草種子的檢驗(yàn)方法，內(nèi)容包括扦樣、凈度分析、發(fā)芽試驗(yàn)、真實(shí)性鑒定、水分測定、四唑測定、重量測定等。[結(jié)果]確定其室內(nèi)檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法，制定了毛雞骨草種子檢驗(yàn)規(guī)程。[結(jié)論]制定的毛雞骨草種子檢驗(yàn)規(guī)程經(jīng)多批次種子質(zhì)量檢驗(yàn)實(shí)踐，是可行的。

關(guān)鍵詞?毛雞骨草;種子檢驗(yàn)規(guī)程;發(fā)芽試驗(yàn);水分測定;四唑測定

中圖分類號(hào)?S567文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A文章編號(hào)?0517-6611（2018）35-0177-03

毛雞骨草為廣西特產(chǎn)、大宗栽培藥材，來源于豆科相思子屬植物毛相思子（Abrus mollis Hance），藥用全株，具有清熱解毒、舒肝止痛的功效，主治黃疸、脅肋不舒、胃脘脹痛、急慢性肝炎、乳腺炎[1]，是廣西玉林制藥集團(tuán)有限責(zé)任公司拳頭產(chǎn)品雞骨草膠囊、復(fù)方雞骨草膠囊等保肝護(hù)肝中成藥的主要原料，長期的使用使野生資源已不能滿足市場需求。從1989年起，經(jīng)應(yīng)用企業(yè)與科研單位共同攻關(guān)，成功實(shí)現(xiàn)了毛雞骨草的野生變家種，并在廣西玉林、北流、陸川、貴港、靈山、百色、凌云、臨桂等地推廣種植。在生產(chǎn)上，毛雞骨草用種子進(jìn)行繁殖，由于缺乏種子質(zhì)量檢驗(yàn)技術(shù)、標(biāo)準(zhǔn)和有效的管理，劣種坑農(nóng)的事件時(shí)有發(fā)生，給藥農(nóng)帶來很大損失，也使藥材生產(chǎn)得不到保障。筆者通過對其種子扦樣、種子質(zhì)量檢驗(yàn)和鑒定方法的研究，獲得其種子檢驗(yàn)規(guī)程，為種子的科研、生產(chǎn)、經(jīng)營、質(zhì)量管理提供依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?供試種子。

來源于廣西玉林制藥集團(tuán)有限責(zé)任公司毛雞骨草種植基地。

1.1.2?儀器及試劑。

各試驗(yàn)所需儀器及試劑見表1[2-5]。

1.2?方法

1.2.1?扦樣[2-4，6]。

通過分析多年調(diào)查結(jié)果，依據(jù)毛雞骨草種子的市場流通情況和單個(gè)種植基地的需種量，從多年多批次樣品的質(zhì)量分析結(jié)果綜合考慮，提出劃分種子批的方法，確定其種子批的最大重量和樣品最小重量，同時(shí)確定初次樣品、混合樣品、送驗(yàn)樣品、試驗(yàn)樣品的獲取方法。

1.2.2?凈度分析。

參照GB/T 3543.2—1995 農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程?凈度分析[7]的方法，參考文獻(xiàn)[2-4]進(jìn)行毛雞骨草種子的凈度分析。

1.2.3?發(fā)芽試驗(yàn)。

設(shè)計(jì)了不同的種子預(yù)處理（破除硬實(shí)、抑菌處理）、發(fā)芽溫度、發(fā)芽床、光照條件各項(xiàng)試驗(yàn)，觀察其幼苗發(fā)芽規(guī)律，總結(jié)其幼苗鑒定及試驗(yàn)持續(xù)時(shí)間[8]。

1.2.4?種子真實(shí)性鑒定[2-4]。

采用種子外觀形態(tài)法。人工或機(jī)械隨機(jī)數(shù)取種子100粒4個(gè)重復(fù)，通過對種子形態(tài)、大小、顏色等特征的鑒定檢驗(yàn)種子真實(shí)性，結(jié)果以真實(shí)種子的平均值表示，保留一位小數(shù)。

1.2.5?水分測定[2-3，9]。

試驗(yàn)方法見表2，試驗(yàn)程序同文獻(xiàn)[9]。

1.2.6?生活力的生化測定——四唑測定（TTC）[2-4，10]。

設(shè)計(jì)了預(yù)濕方法和時(shí)間、染色前的準(zhǔn)備、不同染色液濃度、染色溫度及染色時(shí)間、染色結(jié)果與發(fā)芽試驗(yàn)的結(jié)果對比、染色圖譜的鑒定各項(xiàng)試驗(yàn)。

1.2.7?重量測定。

參照文獻(xiàn)[11]的百粒法、千粒法、全量法，各進(jìn)行4次重復(fù)，對各方法取得的種子實(shí)測千粒重進(jìn)行比較分析，確定最適宜方法[2-5]。

2?結(jié)果與分析

2.1?扦樣

毛雞骨草種子的扦樣，規(guī)定其種子批最大重量為1 000 kg，送驗(yàn)樣品最小重量為500 g，凈度分析試樣最小重量為50 g，其他植物種子計(jì)數(shù)試樣最小重量為500 g，水分測定試樣最小重量為100 g。

在扦樣過程中，劃分種子批的方法為：扦樣前了解所扦取種子的品種、產(chǎn)地、數(shù)量、采收時(shí)間、脫粒及干燥、貯藏方法、貯藏條件、貯藏時(shí)間和貯藏期間發(fā)生的情況、處理方法等。按照同一品種、同一來源、同一年度、同一時(shí)期收獲和質(zhì)量基本一致、在規(guī)定數(shù)量之內(nèi)劃分種子批。

初次樣品的扦取、混合樣品的配制、送驗(yàn)樣品及試驗(yàn)樣品的分取按GB/T 3543.2—1995?農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程?扦樣[6]執(zhí)行。

為最大程度地保證樣品在檢驗(yàn)前后的一致，盡量做到收到樣品就開始檢驗(yàn)，如耽擱，須將樣品保存在涼爽和通風(fēng)良好的室內(nèi)。用于復(fù)驗(yàn)的樣品放在4～8 ℃條件下保存一年。

2.2?凈度分析

在研究過程中發(fā)現(xiàn)，毛雞骨草種子中的成分包含飽滿種子、癟種子、小石粒、小泥塊、小泥粒、毛雞骨草植株和果實(shí)殘片、谷粒等。根據(jù)其種子樣品實(shí)際，參照文獻(xiàn)[7]，毛雞骨草的凈種子除了完整種子，還包括大于原來大小一半、附著種皮的破碎種子;除了凈種子，均為雜質(zhì)，其中重型雜質(zhì)指重量大于種子10倍以上的雜質(zhì)。其他植物種子按凈種子的原則選出。

凈度分析的結(jié)果計(jì)算和表示按GB/T 3543.3—1995 農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程?凈度分析執(zhí)行。

2.3?發(fā)芽試驗(yàn)

綜合種子預(yù)處理、發(fā)芽溫度、發(fā)芽床、光照條件、幼苗鑒定、試驗(yàn)持續(xù)時(shí)間等各項(xiàng)發(fā)芽試驗(yàn)研究結(jié)果[3，8]，毛雞骨草種子的發(fā)芽技術(shù)規(guī)定：從經(jīng)充分混合的凈種子中，用數(shù)種設(shè)備或手工隨機(jī)數(shù)取400粒，分為4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)100粒。發(fā)芽試驗(yàn)的發(fā)芽床為紙上（TP），發(fā)芽溫度為25 ℃或30 ℃，幼苗的初次計(jì)數(shù)時(shí)間為5 d，末次計(jì)數(shù)時(shí)間為10 d。置床前，破除硬實(shí)用95%～98%濃硫酸腐蝕8～9 min或JMNJ-3型精白機(jī)磨2 min/400粒，種子消毒用強(qiáng)氯精500倍液浸泡2 h或0.5% KMnO4水溶液浸泡1 h。結(jié)果計(jì)算和表示按GB/T 3543.4—1995農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程 發(fā)芽試驗(yàn)[12]的規(guī)定執(zhí)行。

2.4?種子真實(shí)性鑒定

毛雞骨草種子真實(shí)性的鑒別依據(jù)：種子卵形或矩圓形，扁平，長3.5～6.0 mm，寬2.3～4.5 mm，厚1.2～2.8 mm。暗褐色、棕色或黑色，表面光亮，常有棕黑相間的花斑。種臍凹陷，線形，種阜小，環(huán)狀。子葉肥大，黃綠色或白色;胚根白色，短小[3]。

2.5?水分測定

種子的水分測定是除去種子中全部的自由水和束縛水，同時(shí)盡最大可能減少氧化、分解或其他揮發(fā)性物質(zhì)的損失[2，13]。由圖1可見，整粒樣品不斷失去水分，并無規(guī)律可循，因此用整粒種子進(jìn)行毛雞骨草種子的水分測定是不可行的。粗磨樣品在試驗(yàn)過程中，先有一個(gè)快速的失水期，然后到一個(gè)較長時(shí)間較緩慢失水的時(shí)期，可以將這個(gè)快速失水期看作失去自由水及部分束縛水，緩慢期看作失去束縛水但未達(dá)到種子物質(zhì)的氧化、分解。從烘干時(shí)間上與GB/T 3543.6—1995規(guī)定的“高恒溫法樣品烘干時(shí)間為1 h、低恒溫烘干法樣品烘干時(shí)間為8 h”較吻合[3-4，14]。因此，通過對樣品處理、烘干溫度、烘干時(shí)間的結(jié)果比較，以快速、簡便為原則，毛雞骨草種子不需預(yù)先烘干的水分測定技術(shù)規(guī)定：用高恒溫烘箱法進(jìn)行，樣品處理為粗磨，鋁盒直徑5.5 cm，樣品量為4～5 g，烘干溫度為130～133 ℃，干燥時(shí)間為2 h。結(jié)果計(jì)算和表示按GB/T 3543.6—1995農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程 水分測定[9]執(zhí)行。

2.6?生活力的生化測定——四唑測定（TTC）

綜合預(yù)濕方法和時(shí)間、染色前的準(zhǔn)備、不同染色液濃度、染色溫度及染色時(shí)間、染色結(jié)果與發(fā)芽試驗(yàn)的結(jié)果對比、染色圖譜的鑒定等試驗(yàn)結(jié)果[10]，毛雞骨草種子四唑測定的技術(shù)規(guī)定：破除硬實(shí)方法同發(fā)芽試驗(yàn)，預(yù)濕方式為紙間或水中，預(yù)濕時(shí)間為30 ℃恒溫水浸種5～6 h或紙間12 h，染色前的準(zhǔn)備為剝?nèi)シN皮，染色液濃度為1%，染色溫度為30 ℃，染色時(shí)間為5～6 h，鑒定時(shí)觀察表面染色情況，全染成紅色或呈略淡的紅色為有生活力種子。

2.7?重量測定

重量測定試驗(yàn)中，毛雞骨草種子的實(shí)測千粒重結(jié)果，百粒法平均為25.77 g，千粒法平均為25.48 g，全量法平均為25.66 g，3種方法所得的結(jié)果在0.05和0.01的顯著水平上沒有顯著差異。說明對于毛雞骨草種子的重量測定，百粒法、千粒法和全量法均適用。從標(biāo)準(zhǔn)化和國際化的角度出發(fā)，選擇百粒法作為毛雞骨草種子的重量測定方法。

3?結(jié)論

綜合以上研究結(jié)果，得到毛雞骨草種子檢驗(yàn)規(guī)程，包括扦樣、凈度分析、發(fā)芽試驗(yàn)、真實(shí)性鑒定、水分測定、四唑測定（TTC）、重量測定。

近年來，研究小組使用此規(guī)程對不同產(chǎn)地和不同年份的43批毛雞骨草種子的質(zhì)量進(jìn)行了檢驗(yàn)，也請廣西藥用植物種子質(zhì)量檢驗(yàn)站的工作人員按此方法進(jìn)行復(fù)檢，檢驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過對比分析發(fā)現(xiàn)其結(jié)果差異在允許的范圍內(nèi)，說明其方法穩(wěn)定可靠。證明了此毛雞骨草種子檢驗(yàn)規(guī)程適用于毛雞骨草種子的生產(chǎn)、經(jīng)營、管理和使用過程的質(zhì)量檢驗(yàn)。

參考文獻(xiàn)

[1] 廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳.廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)[S].南寧：廣西科學(xué)技術(shù)出版社，1990.

[2] 支巨振.《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》實(shí)施指南：GB/T 3543.1～3543.7—1995[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2004.

[3] 董青松.廣州相思子和毛相思子種子標(biāo)準(zhǔn)研究[D].北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)，2007.

[4] 董青松，何俊兵，蒙愛東，等.廣州相思子種子檢驗(yàn)規(guī)程研究[J].種子，2012，31（5）：123-125.

[5] 閆志剛，馬小軍，董青松，等.青蒿種子檢驗(yàn)規(guī)程研究[J].中國種業(yè)，2011（1）：37-40.

[6] 支巨振，畢辛華，杜克敏，等.農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程?扦樣：GB/T 3543.2—1995[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，1995.

[7] 支巨振，畢辛華，杜克敏，等.農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程?凈度分析：GB/T 3543.3—1995[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，1995.

[8] 董青松，陳章源，何俊兵，等.毛相思子種子發(fā)芽試驗(yàn)研究[J].種子，2010，29（4）：12-15.

[9] 支巨振，畢辛華，杜克敏，等.農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程?水分測定：GB/T 3543.6—1995[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，1995.

[10] 韓春艷，孫衛(wèi)邦，董青松，等.廣州相思子和毛相思子種子活力TTC測定方法研究[J].種子，2011，30（7）：13-16.

[11] 支巨振，畢辛華，杜克敏，等.農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程?其他項(xiàng)目檢驗(yàn)：GB/T 3543.7—1995[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，1995.

[12] 支巨振，畢辛華，杜克敏，等.農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程?發(fā)芽試驗(yàn)：GB/T 3543.4—1995[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，1995.

[13] 胡晉，李永平，顏啟傳，等.種子水分測定的原理和方法[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2008.

[14] 董青松，孫衛(wèi)邦，韓春艷，等.廣州相思子種子水分測定的研究[J].中國種業(yè)，2011（4）：48-49.