羅進(jìn)，劉芳梅，趙雷，王凱，胡卓炎

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642）

火龍果(Hylocereus undatusBritt)又稱紅龍果、仙蜜果，是仙人掌科量天尺屬和蛇鞭柱屬植物，性喜溫暖潮濕，耐炎熱，原產(chǎn)于巴西、墨西哥南部及中美洲諸國(guó)的太平洋沿岸地區(qū)[1]，近年在我國(guó)臺(tái)灣、海南、廣東和廣西等地廣泛種植?；瘕埞麪I(yíng)養(yǎng)豐富，富含多種氨基酸和微量元素，深受消費(fèi)者喜愛[2]?；瘕埞雌涔す忸伾饕譃榧t皮白肉、紅皮紅肉、黃皮白肉三大類，紅皮紅肉火龍果由于其果實(shí)中富含的甜菜紅素具有抗氧化[3,4]、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[5,6]和抗癌[7]等功能活性，近年來逐漸受到了人們的關(guān)注。

紅肉火龍果主要以鮮銷為主，但紅肉火龍果不易貯藏，采摘后常溫貯藏3 d，其鱗片出現(xiàn)黃化、萎蔫，果皮出現(xiàn)皺縮等現(xiàn)象[8]，嚴(yán)重影響了紅肉火龍果的銷售。紅肉火龍果色素主要為甜菜紅素，在火龍果果汁、果醬、果酒等產(chǎn)品加工和貯藏中，甜菜紅素受加工參數(shù)如溫度等條件的影響而發(fā)生降解，進(jìn)而影響產(chǎn)品的質(zhì)量。因此，研發(fā)富含甜菜紅素的紅肉火龍果加工產(chǎn)品，不僅能解決紅肉火龍果腐爛造成的資源浪費(fèi)，也能提高紅肉火龍果加工產(chǎn)品的質(zhì)量和附加值，具有重要意義。

目前紅肉火龍果加工相關(guān)產(chǎn)品主要有火龍果酒[9]、火龍果汁[10]、火龍果干[11]和火龍果粉[12]等。關(guān)于紅肉火龍果果汁的研究主要集中于復(fù)合果汁飲料配方[13,14]、果汁滅菌工藝的選擇[15,16]、果汁澄清與護(hù)色工藝研究[17]等。酶法制備紅肉火龍果澄清汁的工藝已有研究，但其主要側(cè)重于果汁的出汁率等指標(biāo)來確定最佳工藝[18,19]，并未考慮紅肉火龍果在酶解工藝過程中其甜菜紅素的影響。利用酶解處理紅肉火龍果果漿，探討不同酶解條件對(duì)紅肉火龍果甜菜紅素保留率、出汁率和澄清效果的影響，采用期望函數(shù)途徑同時(shí)優(yōu)化程序，以期獲得甜菜紅素保留率高、出汁率高和澄清效果好的紅肉火龍果果汁產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

紅肉火龍果(Hylocereus undatusBritt)，產(chǎn)地為廣東省從化市；果膠酶（商品名為S10007，酶活力500 U/mg），上海源葉生物科技有限公司；檸檬酸（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其它試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

WZ103糖度計(jì)，上海天呈科技有限公司；SHA-CA數(shù)顯水浴恒溫振蕩器，常州普天儀器制造有限公司；UVmini-1240紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；TD5-Ⅱ低速離心機(jī)，長(zhǎng)沙平凡儀器儀表公司；TA500質(zhì)構(gòu)測(cè)定儀，英國(guó)勞埃德儀器公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

紅肉火龍果→挑選→清洗→剝皮→破碎→加入果膠酶進(jìn)行處理→鈍化酶活性→快速冷卻→壓榨果汁→離心分離→火龍果澄清汁

1.3.2 酶法制備火龍果澄清汁單因素試驗(yàn)

1.3.2.1 酶添加量對(duì)制備火龍果澄清汁的影響

取50 g火龍果果漿6份，調(diào)節(jié)果漿pH至3.5，果膠酶添加量分別為0、100、200、300、400和500 U/g，混合均勻，于50 ℃水浴中酶解2 h。經(jīng)80 ℃水浴保溫5 min鈍化酶活，分別測(cè)定出汁率、果汁透光率和甜菜紅素含量。

1.3.2.2 酶解時(shí)間對(duì)制備火龍果澄清汁的影響

取50 g火龍果果漿6份，調(diào)節(jié)果漿pH至3.5，果膠酶添加量為300 U/g，混合均勻，于50 ℃水浴下分別酶解0、1、2、3、4和5 h。經(jīng)80 ℃水浴保溫5 min鈍化酶活，分別測(cè)定出汁率、果汁透光率和甜菜紅素含量。

1.3.2.3 酶解溫度對(duì)制備火龍果澄清汁的影響

取50 g火龍果果漿5份，調(diào)節(jié)果漿pH至3.5，果膠酶添加量為300 U/g，混合均勻，選擇酶解溫度20、30、40、50、60 ℃進(jìn)行試驗(yàn)，酶解2 h。經(jīng)80 ℃水浴保溫5 min鈍化酶活，分別測(cè)定出汁率、果汁透光率和甜菜紅素含量。

1.3.2.4 底物pH對(duì)制備火龍果澄清汁的影響

取50 g火龍果果漿5份，使用檸檬酸調(diào)節(jié)果漿pH 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，果膠酶添加量為300 U/g，混合均勻，于50 ℃水浴中酶解2 h。經(jīng)80 ℃水浴保溫5 min鈍化酶活，分別測(cè)定出汁率、果汁透光率和甜菜紅素含量。

1.3.3 酶解參數(shù)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)與優(yōu)化

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，綜合單因素試驗(yàn)所得結(jié)果，選取酶添加量、反應(yīng)溫度、底物pH 3個(gè)因素。以火龍果出汁率、果汁透光率、甜菜紅素保留率為響應(yīng)值，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析方法，運(yùn)用期望函數(shù)同時(shí)優(yōu)化多目標(biāo)途徑，確定酶法制備火龍果果汁的最佳工藝條件。試驗(yàn)因素和水平設(shè)置見表1。

表1 響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì)表Table 1 Response surface level design table

1.3.4 出汁率測(cè)定

果汁出汁率的測(cè)定[20]：將火龍果果漿倒入 200目濾袋中，置于質(zhì)構(gòu)儀操作臺(tái)上，質(zhì)構(gòu)儀設(shè)定固定壓力400.00 N，壓榨時(shí)間10 s，連續(xù)壓榨兩次。

1.3.5 果汁澄清度的測(cè)定

采用分光光度法[21]?；瘕埞麧{經(jīng)酶解，鈍化酶活性，冷卻，壓濾后，經(jīng)3500 r/min離心20 min，取上清液。以蒸餾水為參照物，于660 nm測(cè)定透光率，用透光率T（%）表示果汁的澄清度。

1.3.6 果汁中甜菜紅素的測(cè)定

參考Herbach[22]等人方法。取1 mL果汁于100 mL容量瓶，蒸餾水定容至刻度，搖勻，分別在波長(zhǎng) 537 nm、600 nm處，以蒸餾水為空白參比，測(cè)定其吸光度。

式中：A為537 nm所測(cè)定的吸光度減去600 nm所測(cè)定的吸光度；Mw為甜菜紅素的相對(duì)分子質(zhì)量(Mw=550 g/mol)；DF為稀釋倍數(shù)；ε為甜菜紅素的摩爾吸收率(ε=60000 L/(mol·cm))；l為比色皿的厚度。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)重復(fù)三次，采用 IBM SPSS Statistics 20和SAS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，利用Duncan's均數(shù)差異顯著性分析（p＜0.05），判斷差異顯著性。工藝優(yōu)化運(yùn)用期望函數(shù)同時(shí)優(yōu)化多目標(biāo)途徑的方法[23]。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶解工藝參數(shù)對(duì)火龍果甜菜紅素保留率、出汁率和透光率的影響

2.1.1 酶添加量的影響

酶添加量對(duì)火龍果甜菜紅素保留率、出汁率和透光率的影響結(jié)果見圖1。

圖1 酶添加量對(duì)火龍果甜菜紅素保留率、出汁率和透光率的影響Fig.1 Effects of enzyme addition on the retention rate, juice yield and transmittance of betacyanin in red pitaya juice

由圖1可知，對(duì)于果汁中甜菜紅素變化，其含量隨著果膠酶添加量的增加而顯著減少（p＜0.05），且少量酶的加入便會(huì)引起甜菜紅素的降解，這與甜菜紅素不穩(wěn)定有關(guān)。未經(jīng)酶解的火龍果漿由于其含有高含量果膠，故其直接壓榨所得果汁出汁率較低，僅能達(dá)到45.4±1.9%。果膠酶添加量對(duì)火龍果出汁率的提高有顯著影響，在一定范圍內(nèi)，火龍果澄清汁的出汁率隨果膠酶添加量的增加而顯著升高(p＜0.05)，但在酶添加量達(dá)到300 U/g后，果汁出汁率無顯著增加(p＞0.05)。這是因?yàn)樵诨瘕埞麧{一定時(shí)，其所含的果膠類物質(zhì)的含量一定，過量的果膠酶只能加速酶解反應(yīng)的進(jìn)行，并不能提高出汁率。對(duì)于火龍果果汁的透光率，在添加少量果膠酶后果汁透光率顯著升高(p＜0.05)，果汁品質(zhì)得到提高；但當(dāng)酶添加量達(dá)到300 U/g后，隨著果膠酶添加量的繼續(xù)增加，果汁的透光率會(huì)下降。這是因?yàn)楣z酶是一種蛋白酶，隨著添加量的增加，果汁中酶蛋白含量增加，會(huì)使得果汁變渾濁[24]，可見果膠酶的過多添加并不益于果汁的澄清。綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取酶添加量200～400 U/g進(jìn)行下一步優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.2 酶解時(shí)間的影響

酶解時(shí)間對(duì)火龍果甜菜紅素保留率、出汁率和透光率的影響結(jié)果見圖2。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)對(duì)火龍果甜菜紅素保留率、出汁率和透光率的影響Fig.2 Effects of enzymolysis time on the retention rate, juice yield and transmittance of betacyanin in pitaya juice

由圖2可知，果汁中的甜菜紅素在酶解1 h后其保留率僅為 75.4±1.6%，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，甜菜紅素保留率持續(xù)下降，經(jīng)5 h酶解后，其甜菜紅素保留率僅為62.7±2.1%，為保證果汁中甜菜紅素保留率，酶解時(shí)間不宜過長(zhǎng)。當(dāng)酶解時(shí)間小于2 h時(shí)，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，火龍果澄清汁的出汁率迅速升高，當(dāng)酶解時(shí)間大于2 h時(shí)，果汁出汁率提高緩慢。果汁透光率在酶解1 h后便可得到較大提高，但在2 h后，隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)，其透光率無顯著差異(p＞0.05)。綜合以上結(jié)果，選取酶解時(shí)間2 h左右較為合適。

2.1.3 酶解溫度的影響

酶解溫度對(duì)火龍果甜菜紅素保留率、出汁率和透光率的影響結(jié)果見圖3。由圖3可知，酶解溫度對(duì)果汁中甜菜紅素的含量有顯著影響(p＜0.05)，隨著酶解溫度的升高，所得火龍果果汁中的甜菜紅素含量逐漸下降，并在50 ℃后甜菜紅素降解速率加快，這是因?yàn)樘鸩思t素為熱不穩(wěn)定色素，在加熱條件下，甜菜紅素的1號(hào)位氮原子處會(huì)發(fā)生水解反應(yīng)，水解生成環(huán)多巴-5-葡萄糖苷和甜菜醛氨酸[25]，從而其生物活性降低。隨著酶解溫度的升高，果汁出汁率和透光率逐漸升高，其中火龍果出汁率在50 ℃達(dá)到65.0±0.7%，隨著溫度繼續(xù)增加，當(dāng)酶解溫度高于50 ℃后，其出汁率和透光率開始下降。出汁率和果汁透光率的變化趨勢(shì)與果膠酶的活性相關(guān)，在一定范圍內(nèi)，果膠酶活性隨溫度的升高而升高，并于50 ℃左右活性達(dá)到最高，隨著溫度繼續(xù)升高，果膠酶開始發(fā)生變性，酶活力下降。綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取酶解溫度40～60 ℃進(jìn)行下一步優(yōu)化試驗(yàn)。

圖3 酶解溫度對(duì)對(duì)火龍果甜菜紅素保留率、出汁率和透光率的影響Fig.3 Effects of enzymolysis temperature on the retention rate,juice yield and transmittance of betacyanin in pitaya juice

2.1.4 底物pH的影響

底物pH對(duì)火龍果甜菜紅素保留率、出汁率和透光率的影響結(jié)果見圖4。

由圖4可知，果汁中甜菜紅素在pH 4.5時(shí)保留率最高，達(dá)81.4±2.1%，當(dāng)?shù)孜飌H低于4.5時(shí)，隨著pH的升高，果汁中甜菜紅素的保留率逐漸升高，當(dāng)?shù)孜飌H高于4.5后，隨著pH的升高，甜菜紅素保留率開始下降。底物pH對(duì)火龍果出汁率和透光率有顯著影響。在pH 3.5時(shí)，火龍果出汁率和透光率均達(dá)到最高，分別為65.0±0.7%和89.0±0.8%。出汁率和透光率的變化趨勢(shì)與果膠酶的活性相關(guān)，底物pH會(huì)影響果膠酶的活性，從而對(duì)果汁的出汁率和透光率產(chǎn)生影響。權(quán)衡底物pH對(duì)火龍果果汁出汁率、透光率和甜菜紅素保留率的影響，選取底物pH 3～4進(jìn)行下一步優(yōu)化試驗(yàn)。

圖4 底物pH對(duì)對(duì)火龍果甜菜紅素保留率、出汁率和透光率的影響Fig.4 Effects of substrate pH on the retention rate, juice yield and transmittance of betacyanin in pitaya juice

2.2 酶解工藝參數(shù)與火龍果甜菜紅素保留率、出汁率和透光率的響應(yīng)曲面模型

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取酶解時(shí)間固定為2 h，酶添加量（%）、溫度（℃）、pH三個(gè)因素不同水平對(duì)火龍果甜菜紅素保留率、出汁率和透光率的影響。利用統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

利用統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)表2的數(shù)據(jù)經(jīng)回歸分析得到果汁甜菜紅素保留率、出汁率和透光率的響應(yīng)曲面模型，并對(duì)各響應(yīng)變量模型進(jìn)行失擬性與顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。

結(jié)果表明，火龍果甜菜紅素保留率Y1、出汁率Y2和透光率Y3的失擬性檢驗(yàn)F1在 5%水平不顯著（p＞0.05），說明模型無失擬性因素存在；而各響應(yīng)曲面模型的顯著性F2在1%水平顯著（p＜0.01），說明各模型較好地?cái)M合火龍果出汁率、透光率和甜菜紅素保留率與三個(gè)參試因子之間的關(guān)系，模型的決定系數(shù)R2分別為0.9509、0.9896和0.9366。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Design and results of response surface methodology

7 0 -1 1 84.4 58.5 85.4 8 1 -1 0 76.1 59.6 86.3 9 -1 -1 0 81.7 59.1 85.5 10 0 0 0 72.2 64.8 89.7 11 0 0 0 73.9 65.6 89.9 12 -1 0 1 87.8 59.0 84.6 13 -1 1 0 57.2 56.1 88.5 14 1 0 -1 60.6 62.3 87.6 15 0 0 0 72.2 65.1 89.9 16 1 1 0 55.3 59.3 86.6 17 0 1 -1 53.9 58.2 88.1

表3 酶添加量、酶解溫度和底物pH與火龍果甜菜紅素保留率Y1、出汁率Y2和透光率Y3的響應(yīng)面模型Table 3 The regression models of Y1 retention rate of betacyanin, Y2 juice yield, and Y3 juice transmittance with independent variables ofX1 enzyme concentration, X2 temperature and X3 substrate pH

2.3 酶解工藝各因素對(duì)火龍果甜菜紅素保留率、出汁率和透光率影響的顯著性

圖5 各因素對(duì)酶解火龍果果汁甜菜紅素保留率Y1、出汁率Y2和透光率Y3的影響作用顯著性Fig.5 Pareto chart of effects of various factors on the (a): Y1,retention rate of betacyanin; (b): Y2, juice yield; and (c): Y3,juice transmittance

對(duì)酶解工藝各因素的二次項(xiàng)、一次項(xiàng)及其交互項(xiàng)對(duì)火龍果甜菜紅素保留率、出汁率和透光率的影響作用顯著性統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如圖5所示。

由圖5a可知，對(duì)于酶解火龍果果汁的甜菜紅素的保留率Y1，酶解溫度和底物pH一次項(xiàng)有極顯著的影響（p＜0.01），酶解溫度二次項(xiàng)影響也顯著（p＜0.05）。其他因素及之間的交互作用對(duì)果汁中甜菜紅素保留率影響不顯著。酶解溫度是重要參數(shù)，從圖3結(jié)果可知，50 ℃時(shí)出汁率最高，但對(duì)甜菜紅素的保留不利，故應(yīng)考慮以甜菜紅素的保留為重要目標(biāo)，兼顧出汁率和透光率目標(biāo)，采用多目標(biāo)同時(shí)優(yōu)化工藝，更符合實(shí)際生產(chǎn)情況。

由圖5b可知，對(duì)于酶解火龍果出汁率Y2，酶解溫度、底物pH和酶添加量的二次項(xiàng)均有極顯著的影響（p＜0.01）。酶添加量、酶解溫度、底物pH一次項(xiàng)和酶添加量與溫度、底物pH的交互作用也會(huì)顯著影響果汁出汁率（p＜0.05）。

由圖5c可知，對(duì)于酶解火龍果果汁的透光率Y3，底物pH和酶添加量二次項(xiàng)有極顯著影響（p＜0.01），底物pH和酶解溫度一次項(xiàng)有顯著影響（p＜0.05）。

2.4 酶解工藝條件期望函數(shù)多目標(biāo)優(yōu)化

根據(jù)表2的試驗(yàn)結(jié)果，選取各響應(yīng)值最大值為指標(biāo)目標(biāo)，并且考慮甜菜紅素保留率指標(biāo)為最重要，出汁率為其次，選取的優(yōu)化參數(shù)見表 4。運(yùn)行統(tǒng)計(jì)軟件期望函數(shù)途徑優(yōu)化多目標(biāo)程序，求出獲得總體期望值最大時(shí)的X1、X2、X3的優(yōu)化組合，結(jié)果見表5。

表4 優(yōu)化參數(shù)Table 4 The parameters used for optimization

表5 優(yōu)化的酶解工藝條件編碼水平值及預(yù)測(cè)值Table 5 The coded variable levels and predicted responses under optimum conditions

由表5可看出，酶解工藝參數(shù)優(yōu)化條件為：酶添加量X1在-0.17水平（實(shí)際取值285 U/g）；酶解溫度X2在-0.36水平（實(shí)際取值46 ℃）；底物pH在0.42水平(實(shí)際取值pH 3.7)，酶解時(shí)間2 h，火龍果汁甜菜紅素保留率、出汁率和透光率同時(shí)達(dá)到最大，預(yù)測(cè)值分別為80.3%，63.9%和88.4%。通過驗(yàn)證試驗(yàn)，在此條件下火龍果的甜菜紅素保留率為 80.8±1.8%，出汁率為64.4±2.3%，透光率為89.5±0.8%，均與預(yù)測(cè)值相符。研究結(jié)果可為實(shí)際生產(chǎn)提供參考。

3 結(jié)論

3.1 在探討了酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度和底物pH等單因素對(duì)火龍果果汁甜菜紅素穩(wěn)定性、出汁率和透光率的影響的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法分析，運(yùn)行統(tǒng)計(jì)軟件期望函數(shù)途徑優(yōu)化多目標(biāo)程序，獲得酶法制備火龍果汁的甜菜紅素穩(wěn)定性、出汁率和透光率多目標(biāo)優(yōu)化的工藝參數(shù)。

3.2 當(dāng)果膠酶添加量為285 U/g，酶解溫度46 ℃，底物pH為3.7，酶解時(shí)間2 h時(shí)，火龍果中的甜菜紅素保留率可達(dá)到80.8%，出汁率可達(dá)到64.4%，透光率可達(dá)到89.5%。通過對(duì)所得模型的方差分析和響應(yīng)面分析表明，試驗(yàn)所建立的模型回歸性顯著，試驗(yàn)擬合較好。該工藝較好地保留了紅心火龍果汁原有的色澤，同時(shí)獲得高的出汁率和透光率，對(duì)實(shí)際生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。

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