賀繼剛，韓金秀，李貝貝，李宏遠(yuǎn)，嚴(yán)丹，任靖宇*

本研究背景：

冠心病位居世界人口死亡原因首位。目前國內(nèi)外對冠心病的治療主要分為：外科治療、內(nèi)科治療及細(xì)胞治療。細(xì)胞治療中應(yīng)用最為成熟的是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs），雖然已有大量文獻(xiàn)證實BMSCs可以改善心肌梗死后心功能。但干細(xì)胞臨床應(yīng)用尚不成熟，而GATA-4是調(diào)控心臟基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子。目前已經(jīng)證明過表達(dá)GATA-4的BMSCs可以通過促進(jìn)BMSCs向心肌細(xì)胞分化，從而有效改善心肌梗死后心功能。然而轉(zhuǎn)染基因干細(xì)胞的致瘤性使干細(xì)胞的臨床應(yīng)用前景遙遙無期。有什么可以讓細(xì)胞修復(fù)的優(yōu)勢凸顯，而同時又可以規(guī)避其風(fēng)險呢？本研究將目光聚焦于細(xì)胞分泌的外泌體。外泌體是從細(xì)胞上產(chǎn)生的鱗片狀脫落的囊泡，具有多種生物學(xué)功能，可以使細(xì)胞在不需要直接接觸下完成細(xì)胞間生物信號的傳導(dǎo)，其在細(xì)胞保護(hù)、免疫、疾病診斷等方面成為目前研究的熱點(diǎn)?；诖?，本研究采用過表達(dá)GATA-4的小鼠BMSCs分泌的外泌體，證明其可以充分有效促進(jìn)BMSCs向心肌細(xì)胞分化。

冠心病引起的心肌梗死（即心肌損傷）已成為目前世界范圍內(nèi)的頭號“殺手”。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計：2000—2012年冠心病位居世界人口死亡原因首位［1-2］。目前干細(xì)胞治療成為研究熱點(diǎn)，尤其是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs），雖然已有大量文獻(xiàn)證實BMSCs可以改善心肌梗死后心功能［3］。但亦有更多的學(xué)者提出，干細(xì)胞應(yīng)用臨床尚不成熟，主要原因在于BMSCs安全性一直受到廣泛懷疑［4］。本課題組前期研究已經(jīng)證明過表達(dá)GATA-4可以有效促進(jìn)BMSCs向心肌細(xì)胞分化［5］。在此研究基礎(chǔ)上，本課題組將目光進(jìn)一步聚焦于細(xì)胞分泌的外泌體。外泌體具有多種生物學(xué)功能，可以使細(xì)胞在不需要直接接觸下完成細(xì)胞間生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。本研究利用慢病毒攜帶GATA-4轉(zhuǎn)染小鼠BMSCs并提取分泌的外泌體，通過與BMSCs共培養(yǎng)后采用免疫熒光、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）證明過表達(dá)GATA-4的小鼠BMSCs分泌的外泌體可以有效促進(jìn)BMSCs向心肌細(xì)胞分化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2016年1—6月選取健康4周齡SPF級C57BL/6小鼠10只，均為雄性，體質(zhì)量20～25 g，由成都達(dá)碩實驗動物有限公司提供，動物許可證號為SCXK（川）2015-030。

1.2 主要試劑和儀器 C57BL/6小鼠BMSCs完全培養(yǎng)基（低糖培養(yǎng)基，含10%胎牛血清）購自美國Cyagen Biosciences公司，肌鈣蛋白T（cTnT）、α肌動蛋白（α-actin）、肌間線蛋白（Desmin）購自英國Abcam公司，Connexin 43購自美國Proteintech Group公司，CD29、CD44、CD11b、干細(xì)胞抗原 1（Sca-1）抗體購自美國BioLegend公司，ExoQuick-TC購自美國System Biosciences公司，CD11bMicroBeads購于美國Miltenyi公司，熒光共聚焦顯微鏡購自日本Nikon90i。

1.3 小鼠BMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定 取C57BL/6小鼠，脫頸處死，75%乙醇溶液浸泡15 min，取出股骨和脛骨，再以75%乙醇溶液浸泡1～2 min，置于0.9%氯化鈉溶液中，兩端剪斷暴露骨髓腔。用1 ml注射器將0.9%氯化鈉溶液沖出骨髓，收集致無菌離心管中，以1 500×g離心10 min后，以含10%胎牛血清的C57BL/6小鼠BMSCs完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，以2×106/cm2密度接種至25 cm2塑料培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。并標(biāo)記為原代（passage 0，P0）。胰酶消化傳代至第3代時采用CD11b的磁珠負(fù)選，去除造血干祖細(xì)胞。繼續(xù)傳代至第7代。取生長至第7代的BMSCs，待細(xì)胞融合達(dá)80%～90%時，制備單細(xì)胞懸液，采用流式細(xì)胞檢測CD29、CD44、CD11b、SCA-1〔PE-CD29單抗 5 μl按 1∶20 稀釋至 100 μl、PE-CD11b單 抗 5 μl按 1∶40 稀 釋 至 100 μl、PE/Cy5-CD445 μl按1∶20稀釋至100 μl、異硫氰酸熒光素（FITC） antimouse SCA-1 5 μl按 1∶20 稀釋至 100 μl〕。

1.4 慢病毒載體及基因開啟技術(shù)構(gòu)建過表達(dá)GATA-4-BMSCs 將已構(gòu)建成功的GATA-4基因插入慢病毒包裝質(zhì)粒GV308中，構(gòu)建GV308-GATA-4重組慢病毒包裝質(zhì)粒。將構(gòu)建成功的GV308-GATA-4重組慢病毒包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入小鼠BMSCs并加入基因開啟劑多西環(huán)素（DOX）。轉(zhuǎn)染成功后利用qPCR方法檢測轉(zhuǎn)染72 h過表達(dá)GATA-4組及陰性對照組GATA-4 mRNA表達(dá)水平，具體過程參考文獻(xiàn)［5］。

1.5 外泌體提取及檢測 按照ExoQuick-TC說明書提取外泌體：收集培養(yǎng)基，3 000×g離心15 min，以去除細(xì)胞及細(xì)胞碎片；并將上清液轉(zhuǎn)移至無菌管中，加入適當(dāng)體積的ExoQuick-TC 外泌體沉淀液（見說明書）。反復(fù)顛倒或輕彈試管使其混勻。冷藏（4 ℃）過夜。保溫培養(yǎng)過程中無需旋轉(zhuǎn)試管。 以1 500×g離心30 min ExoQuick-TC體液混合液。外泌體沉淀位于試管底部，呈淺褐色或白色。吸出上清液，1 500×g離心5 min以沉降殘余的ExoQuick-TC溶液。小心地吸干所有液體，不破壞已沉淀的外泌體。并利用電鏡檢測提取外泌體形態(tài)。

1.6 免疫熒光定性檢測各組cTnT、α-actin、Connexin 43、Desmin表 達(dá) 將GATA-4-BMSCs-外 泌 體 與BMSCs共同培養(yǎng)（A組），空載體-BMSCs-外泌體與BMSCs共同培養(yǎng)（B組），BMSCs-外泌體與BMSCs共同培養(yǎng)（C組），BMSCs單獨(dú)培養(yǎng)（D組）及小鼠心肌細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)（E組）72 h，將共同培養(yǎng)及單獨(dú)培養(yǎng)完成的細(xì)胞，加合適濃度的一抗（cTnT 20 μg/ml，α-actin 50 μg/ml，Connexin 43 30 μg/ml，Desmin 0.6 μg/ml）。再加入合適濃度的熒光標(biāo)記二抗（0.5 mg/ml，稀釋比例1∶1 000），采用熒光共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞cTnT、α-actin、Connexin 43、Desmin表達(dá)情況。

1.7 qPCR法定量檢測各組cTnT、α-actin、Connexin 43、Desmin表 達(dá) 將GATA-4-BMSCs-外 泌 體 與BMSCs共同培養(yǎng)（A組），空載體-BMSCs-外泌體與BMSCs共同培養(yǎng)（B組），BMSCs-外泌體與BMSCs共同培養(yǎng)（C組），BMSCs單獨(dú)培養(yǎng)（D組）及小鼠心肌細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)（E組）72 h，應(yīng)用beacon designer 7.90設(shè) 計qPCR引 物，cTnT上 游 引 物：5′-AATGAAGACCAACTGAGA-3′，下游引物：5′-TATTTCTGCTGCTTGAAC-3′；α-actin上游引物：5′-GAGTAATGGTTGGAATGG-3′，下游引物：5′-GTTCTATCGGATACTTCAG-3′；Connexin 43上游引物：5′-TCAAGAAGTTCAAGTATGG-3′，下游引物：5′-ATGCTGATGATGTAGGTT-3′；Desmin上游引物：5′-CGTGACAACCTGATAGAC-3′，下游引物：5′-TTCTCTGCTTCTTCTCTTAG-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 10 min；95 ℃變性 15 s，60 ℃退火 30 s，95 ℃延伸15 s，共40～45個循環(huán)。完成總RNA提取，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，完成目的基因擴(kuò)增。收集信息，做Ct值分析（計算與統(tǒng)計分析軟件 LERTPA-V 1.0）。實驗重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠BMSCs流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果 小鼠BMSCs CD29表達(dá)率為98.0%、CD44表達(dá)率為100.0%、CD11b表達(dá)率為0.1%、Sca-1表達(dá)率為99.5%。

2.2 轉(zhuǎn)染72 h后GATA-4 mRNA表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染72 h后，過表達(dá)GATA-4組GATA-4 mRNA表達(dá)水平為（78.17±1.32），陰性對照組GATA-4 mRNA表達(dá)水平為（0.57±0.34），過表達(dá)GATA-4組GATA-4 mRNA表達(dá)水平較陰性對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.576，P<0.05）。

2.3 外泌體 外泌體電鏡圖片顯示，大小介于40～100 nm顆粒成團(tuán)聚集，為BMSCs分泌出的外泌體（見圖1，本文彩圖見本刊官網(wǎng)www.chinagp.net電子期刊相應(yīng)文章）。

圖1 ExoQuick-TC法提取外泌體電鏡圖片（×5 000）Figure 1 Exosomes extracted by ExoQuick-TC

2.4 免疫熒光定性檢測各組cTnT、α-actin、Connexin 43、Desmin表 達(dá) A組 GATA-4-BMSCs-外 泌 體 與BMSCs共同培養(yǎng)72 h可見細(xì)胞核被DAPI染為藍(lán)色，表達(dá)出綠色的cTnT、α-actin、Connexin 43、Desmin；B、C、D組可見細(xì)胞核被DAPI染為藍(lán)色，沒有表達(dá)出綠色的cTnT、α-actin、Connexin 43、Desmin；E組可見細(xì)胞核被DAPI染為藍(lán)色，表達(dá)出綠色的cTnT、α-actin、Connexin 43、Desmin（見圖2）。

2.5 qPCR法定量檢測各組cTnT、α-actin、Connexin 43、Desmin表達(dá) 5組cTnT、α-actin、Connexin 43、Desmin表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；其中E組cTnT、α-actin、Connexin 43、Desmin表達(dá)水平較A組升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；A組和E組cTnT、α-actin、Connexin 43、Desmin表達(dá)水平較B組、C組和D組升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，見表1）。

3 討論

2003年美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）率先批準(zhǔn)BMSCs用于心肌梗死的治療。多年來，科學(xué)界一直研究采用無細(xì)胞方法治療心肌梗死。前期為了使BMSCs更好地向心肌細(xì)胞分化，本課題組采用慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs使其可以過表達(dá) GATA-4［5］。

GATA-4在心臟發(fā)育的早期起重要作用，抑制其表達(dá)，可以阻斷P19畸胎瘤細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，強(qiáng)表達(dá)則增強(qiáng)心肌細(xì)胞分化［6］。

圖2 免疫熒光定性檢測各組cTnT、α-actin、Connexin 43、Desmin表達(dá)（×400）Figure 2 Expressions of cTnT，α-actin，Connexin 43 and Desmin in groups A，B，C，D and E stained by immunofluorescence

表 1 各組 cTnT、α-actin、Connexin 43、Desmin表達(dá)水平比較（s，n=3）Table 1 Comparison of expressions of cTnT，α-actin，Connexin 43 and Desmin in groups A，B，C，D and E

表 1 各組 cTnT、α-actin、Connexin 43、Desmin表達(dá)水平比較（s，n=3）Table 1 Comparison of expressions of cTnT，α-actin，Connexin 43 and Desmin in groups A，B，C，D and E

注：cTnT=肌鈣蛋白T，α-actin=α肌動蛋白，Desmin=肌間線蛋白；與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05；與C組比較，cP<0.05；與D組比較，dP<0.05

組別 cTnT α-actin Connexin 43 Desmin A 組 3.37±0.20 4.65±0.20 4.55±0.22 4.45±0.39 B 組 1.37±0.30a 1.18±0.09a 1.09±0.14a 1.50±0.32a C 組 1.29±0.29a 1.49±0.20a 1.63±0.37a 1.42±0.18a D組 1.00a 1.00a 1.00a 1.00a E 組 5.00±0.00abcd 5.28±0.33abcd 5.69±0.21abcd 5.09±0.05abcd F值 5.564 7.033 6.328 5.794 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

外泌體是小的膜性囊泡，從20世紀(jì)90年代起受到極大關(guān)注［7-8］。外泌體于1981年首先提出，是從細(xì)胞上產(chǎn)生的鱗片狀脫落的囊泡，具有胞外酶的活性［9］。外泌體可能扮演細(xì)胞與細(xì)胞之間的信號作用，可以遠(yuǎn)距離運(yùn)輸并將所攜帶物質(zhì)釋放入細(xì)胞影響受體細(xì)胞的處理過程。例如，RNA從一個細(xì)胞穿梭到另一個細(xì)胞，被稱為“外泌體載體RNA”，能夠影響受體細(xì)胞的蛋白質(zhì)產(chǎn)生［10-11］。外泌體不但有免疫調(diào)節(jié)作用，還有減輕心肌缺血/再灌注損傷的效果。TIMMERS等［12］報道，為了更好地理解外泌體的心肌保護(hù)作用，將間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）培養(yǎng)基采用濾膜將其內(nèi)部成分系統(tǒng)性的分為各個等級大小，表明具有心肌保護(hù)成分為＞1 000 kPa。即心肌保護(hù)是由直徑為50～100 nm的囊泡所介導(dǎo)的［12］。MSCs營養(yǎng)改善心肌缺血已有大量研究，據(jù)TANG等［13］報道MSCs進(jìn)入缺血心臟，可以減少組織反應(yīng)，增加血管生成及減少細(xì)胞的凋亡，相比用MSCs轉(zhuǎn)化，其旁分泌可以更好地解釋這些效果。迄今為止，總是將MSCs的旁分泌局限于細(xì)胞因子、化學(xué)因子及介導(dǎo)于細(xì)胞間信號的生長因子。而外泌體的出現(xiàn)從根本上改變了當(dāng)前對MSCs旁分泌的理解。

本實驗正是在上述研究基礎(chǔ)上采用GATA-4-BMSCs-外泌體與BMSCs共同培養(yǎng)，空載體-BMSCs-外泌體與BMSCs共同培養(yǎng)，BMSCs-外泌體與BMSCs共同培養(yǎng)，BMSCs單獨(dú)培養(yǎng)及小鼠心肌細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)72 h后，采用免疫熒光檢測心肌特異性抗原cTnT、α-actin、Connexin 43、Desmin表達(dá)。并進(jìn)一步利用qPCR的方法，定量檢測上述心肌特異性抗原的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)GATA-4-BMSCs-外泌體與BMSCs共同培養(yǎng)cTnT、α-actin、Connexin 43、Desmin表達(dá)水平低于小鼠心肌細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)，但較其他增多。證實過表達(dá)GATA-4-BMSCs分泌的外泌體可以有效促進(jìn)BMSCs向心肌細(xì)胞分化。

綜上所述，過表達(dá)GATA-4的BMSCs分泌的外泌體可以更為有效地促進(jìn)BMSCs向心肌細(xì)胞分化。

本文無利益沖突。

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