顏春魯，李盛華，安方玉，劉永琦，夏鵬飛，馬正民，牛彥強，柳鵬瑤

（1.甘肅中醫(yī)藥大學教學實驗實訓中心，2.微生物與免疫教研室，3.科研實驗中心，4.中醫(yī)臨床學院，5.臨床學院，6.甘肅省高校中藏藥化學與質(zhì)量研究省級重點實驗室，蘭州730000）

膝骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis of the knee，KOA）主要病理特征以膝關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生退變、軟骨基質(zhì)發(fā)生降解為主，繼發(fā)滑膜炎癥和骨質(zhì)增生，引發(fā)關(guān)節(jié)疼痛、腫脹及功能障礙，嚴重影響患者的生存質(zhì)量。預防和阻止膝關(guān)節(jié)軟骨退變、降低軟骨基質(zhì)的降解是治療KOA的關(guān)鍵之所在。一些研究表明，KOA的發(fā)病機制涉及到Wnt信號轉(zhuǎn)導通路中的某些因子表達出現(xiàn)異常。Dickkopf同源物1（Dickkopf homolog 1，DKK1）、Wnt誘導分泌蛋白 1（Wnt induced secreted protein 1，WISP1）和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5（low density lipoprotein receptor related protein 5，LRP5）是 Wnt信號轉(zhuǎn)導通路中的重要信號蛋白質(zhì)［1-3］。發(fā)現(xiàn)膝骨性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)液中WISP1含量增加［2］。另外，WISP 1蛋白質(zhì)過度表達可導致關(guān)節(jié)軟骨的損傷［4］。姜旭等［5］研究也發(fā)現(xiàn)，在骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）關(guān)節(jié)軟骨中 WISP 1、Wnt和βcatenin基因mRNA及蛋白質(zhì)水平明顯增高。因此，調(diào)節(jié)Wnt／β-catenin信號通路及通路中相關(guān)蛋白質(zhì)的表達可能是治療KOA的新靶點，可為防治膝骨性關(guān)節(jié)炎提供新的思考。

右歸丸出自《景岳全書》。方中附子、肉桂、鹿角膠培補腎中元陽，溫里祛寒，為君藥。熟地黃、山茱萸、枸杞子、山藥滋陰益腎，養(yǎng)肝補脾，填精補髓，取“陰中求陽”之義，為臣藥。再用菟絲子、杜仲補肝腎，強腰膝，配以當歸養(yǎng)血和血，共補肝腎精血，為佐藥。全方共湊具有溫陽補腎、填精補髓之功效。研究發(fā)現(xiàn)［6，7］，針刺、艾灸聯(lián)合右歸丸治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的有效率為90.2%，安絡痛膠囊聯(lián)合右歸丸治療陽虛寒凝型膝骨性關(guān)節(jié)炎療效96.67%，但是右歸丸治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的具體機制未明。本實驗采用改良Hulth法復制膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型，探討Wnt／β-catenin信號通路在KOA發(fā)生、發(fā)展中的分子調(diào)控機理，明確其在退行性骨關(guān)節(jié)病變中的作用。進一步揭示右歸丸對KOA的作用機制，為右歸丸臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級 SD大鼠60只，體重（180±20）g，雌雄各半，由甘肅中醫(yī)藥大學科研實驗中心提供。實驗動物質(zhì)量合格證編號：SYXK（甘）2015-0005。

1.2 藥物與試劑

右歸丸購自仲景宛西制藥股份有限公司；硫酸氨基葡萄糖片購自新興同仁藥業(yè)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑2×prime script RTmastermix和熒光定量SYBR PRemix EX TaqⅡ均購自寶生物；DKK1抗體、WISP1抗體、Wnt1抗體、LRP5抗體和β-catenin抗體均購自Abcam。

1.3 實驗儀器

FA2004N型電子天平（上海精密科學儀器有限公司），ZY12306型微量加樣器（ScienTiFic產(chǎn)品），DW-86L338型超低溫冰箱（青島海爾特種電器有限公司），Dynamic VELOCITY 18R臺式高速冷凍離心機，ChemiDocTMXRS+型凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），PowerPac Basic型數(shù)顯雙穩(wěn)定時電泳儀（美國 Bio-Rad公司），CFX96TM型 Real-time熒光定量PCR儀 （美國Bio-Rad），BioMate 3S型蛋白（核酸）濃度測定儀（Thermo），SK-1型快速混勻器（金壇市恒豐儀器廠）。

1.4 動物分組、造模及給藥

60只SD大鼠雌雄各半，適應性飼養(yǎng)1周后，按體重隨機分為6組（n＝10）：隨機選取一組為假手術(shù)組，其余各組用改良Hulth法復制大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型［8，9］。腹腔注射 10%水合氯醛（0.3ml／100 g）麻醉各組大鼠后，雙側(cè)膝關(guān)節(jié)手術(shù)區(qū)常規(guī)消毒，無菌條件下將雙側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)縱向切開長約2 cm，逐層暴露關(guān)節(jié)腔，剔除膝前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶及內(nèi)側(cè)半月板，注意勿損傷關(guān)節(jié)軟骨面。用潔凈的5 ml注射器吸取生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔3～5次，行抽屜試驗陽性后徹底止血，逐層縫合。將假手術(shù)組SD大鼠從膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)打開關(guān)節(jié)腔，不破壞韌帶、半月板，保留關(guān)節(jié)軟骨面?？p合傷口前均滴入少量的青霉素溶液，隨后逐層縫合。術(shù)后連續(xù)3 d肌肉注射青霉素2×105U／d，各組大鼠均在相同條件下飼養(yǎng)，自由飲水、攝食。手術(shù)造模6周后，假手術(shù)組和模型組灌服蒸餾水；按人和動物的體表面積計算法計算藥物用量。硫酸氨基葡萄糖組按0.17 g／kg灌服硫酸氨基葡萄糖。右歸丸由熟地24 g、山藥12 g、山茱萸9 g、枸杞子 9 g、鹿角膠12 g、菟絲子12 g、杜仲12 g、當歸9 g、肉桂 6 g、制附子 6 g等組成，111 g×0.018×5～10 g／kg。常規(guī)水煎，制成濃度為生藥1 g／ml的藥液；右歸丸高、中、低劑量組分別按（20 g／kg、10 g／kg、5 g／kg）灌服相應的藥物，灌服體積為 2ml／200 g，干預8周。末次給藥后無菌條件下分離膝關(guān)節(jié)，部分膝關(guān)節(jié)分裝于含4%多聚甲醛的磨口瓶中，用于組織形態(tài)學觀察；部分膝關(guān)節(jié)分裝于凍存管中，于-80℃冰箱保存，用RT-PCR法和Western blot法檢測關(guān)節(jié)軟骨中mRNA和蛋白質(zhì)的表達。

1.5 一般情況

觀察大鼠的飲食、飲水、活動度、靈敏度、精神狀態(tài)，膝關(guān)節(jié)的畸形、腫脹、活動情況，雙下肢肢端血運及肌肉豐滿程度。

1.6 關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)學變化的觀察

膝關(guān)節(jié)軟骨脫鈣后，按照HE染色方法進行染色。光鏡下觀察膝關(guān)節(jié)軟骨細胞的形態(tài)學變化并進行Mankin評分［10］。具體評分標準如下：0分，軟骨結(jié)構(gòu)光整如常，軟骨細胞數(shù)量如常，基質(zhì)染色正常，潮線比較完整；1分，軟骨表面有不規(guī)則裂隙，軟骨細胞數(shù)量彌漫性增多，基質(zhì)染色減退，出現(xiàn)多重潮線；2分，軟骨裂隙深達肌層，軟骨細胞成簇生長，基質(zhì)染色明顯減退，軟骨下血管浸入肌層；3分，軟骨裂隙深達輻射層，軟骨細胞數(shù)量明顯減少，基質(zhì)染色明顯減退；4分，軟骨裂隙深達鈣化層，基質(zhì)染色完全消失；5分，軟骨層脫落。

1.7 DKK1、W ISP1、Wnt1、β-catenin和 LRP5 mRNA表達的測定

按Qiangen公司RNA提取試劑盒說明書提取軟骨組織RNA，測其濃度和A260nm／A280nm比值后，42℃30min，85℃5min進行cDNA鏈的合成，95℃5min，95℃ 10 s，55℃ 20 s，75℃ 30 s，45個循環(huán)進行實時熒光定量PCR擴增反應。每樣品重復3次，數(shù)據(jù)記錄采用相對定量法，以 2-△△Ct表示樣本中目的基因相對表達含量。其中 DKK1、WISP1、Wnt1、β-catenin、LRP5及β-actin等引物根據(jù)GenBank基因序列使用Oligo 6.0設計，由寶生物工程（大連）有限公司合成。引物序列如下：DKK1下游引物：5’-GAAGGTCTGGCTTGCAGGATA-3’，上游引物：5’-TCCATCGCATTTAGGCTGTTG-3’；WISP1下游引物：5’-CAGTCCTGATGGTGGGCAAC-3’，上 游 引 物：5’-ACACGGCCACTTGCAGAA-3’；Wnt1下游引物：5’-GCTGTGATGACGTGGGAAATA-3’，上游引物：5’-GAGGCATGGTTCACTGTTCA-3’；β-catenin下游引物：5’-GTCTGAGGACAAGCCACAGGACTAC-3’，上 游 引 物：5’-AATGTCCAGTCCGAGATCAGCA-3’；LRP5下游引物：5’-ACCATTGATTACGCCGACCAG-3’，上游引物：5’-ATCGCTATATTGAGTCAGGCCAAAG-3；β-actin下游引物：5’-TTGCTGATCCACATCTGCT-3’，上 游 引 物：GACAGGATGCAGAAGGAGAT。

1.8 DKK1、W ISP1、Wnt1、β-catenin和 LRP5蛋白質(zhì)表達的測定

用RIPA裂解液提取軟骨組織蛋白質(zhì)，BCA法測定蛋白質(zhì)含量，調(diào)整蛋白質(zhì)濃度為30μg／10μl。每孔點樣 15μl，作 SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉、滴加抗DKK1、WISP1、Wnt1、β-catenin和 LRP5等一抗孵育，用山羊抗兔IgG二抗孵育。采用ECL Plus超敏發(fā)光液染色觀察，將溶液 A和 B等體積混勻后，按約0.125ml／cm2膜面積進行染色，室溫反應1min后置于Image Lab 3.0進行曝光，曝光條件為：單個曝光時間10 s，總曝光時間60 s。

1.9 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行處理，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way-Anova）。

2 結(jié)果

2.1 動物一般情況觀察

實驗期間未出現(xiàn)動物死亡現(xiàn)象。實驗期間假手術(shù)組大鼠飲食、飲水、活動如常，反應比較靈敏，精神狀態(tài)良好；膝關(guān)節(jié)未出現(xiàn)畸形、腫脹，活動良好，雙下肢端血運正常，肌肉未發(fā)生萎縮。模型組大鼠飲食、飲水、活動情況較模型組好、靈敏度及精神狀態(tài)均明顯變差，膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)內(nèi)翻畸形、腫脹，雙下肢端血運變差，肌肉發(fā)生萎縮。右歸丸各干預組及硫酸氨基葡萄糖組大鼠飲食、飲水、活動情況較模型組好，靈敏度及精神狀態(tài)也有所好轉(zhuǎn)，膝關(guān)節(jié)腫脹程度、肌肉萎縮程度均較模型組顯著改善，肢端血運明顯恢復。

2.2 右歸丸對關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠關(guān)節(jié)面完整、光滑，滑膜完整，軟骨細胞排列整齊，呈水平排列；軟骨周圍細胞較小，扁平形，排列密集，其長軸平行于軟骨表面；中心細胞較大呈圓形或橢圓形，同源細胞群排列。模型組大鼠關(guān)節(jié)面破損嚴重，軟骨組織大量脫落，軟骨細胞正常排列改變，排列紊亂，有簇聚現(xiàn)象，細胞數(shù)目增多，空泡變大。各干預組大鼠軟骨細胞排列紊亂，由平行排列變?yōu)榭v行排列，細胞數(shù)目增多。其中，右歸丸高劑量組和硫酸氨基葡萄糖組大鼠軟骨細胞排列整齊，分布均勻，鈣化層軟骨細胞輕度成簇，潮線尚完整。Mankin評分結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組及各干預組大鼠Mankin評分均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，右歸丸高劑量組和硫酸氨基葡萄糖組大鼠Mankin評分均明顯降低（P＜0.05）；與硫酸氨基葡萄糖組比較，右歸丸低、中劑量組大鼠 Mankin評分均明顯升高（P＜0.05，圖 1，表 1）。

Tab.1 Mankin scores ofmorphology structure of articular cartilage in each group（，n＝10）

Tab.1 Mankin scores ofmorphology structure of articular cartilage in each group（，n＝10）

*P＜0.05 vs sham group；＃P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs glucosamine sulfate group

Group Mankin scores Sham 0.20±0.089 Model 4.55±0.599*Glucosamine sulfate 2.55±0.896*＃Youguipill low-dose 3.91±0.553*△Youguipillmiddle-dose 3.82±0.579*△Youguipill high-dose 2.88±0.680*＃

2.3 右歸丸對軟骨組織 DKK1、W ISP1、Wnt1、βcatenin和LRP5 mRNA表達的影響

與假手術(shù)組比較，模型組和各干預組大鼠軟骨組織 WISP1、Wnt1、β-catenin和 LRP5 mRNA表達增高，模型組和右歸丸低劑量組DKK1 mRNA表達降低（P＜0.05）。與模型組比較，右歸丸高劑量組和硫酸氨基葡萄糖組大鼠 WISP1、Wnt1、β-catenin和LRP5mRNA表達降低，DKK1 mRNA表達升高（P＜0.05）。與硫酸氨基葡萄糖組比較，右歸丸低、中劑量WISP1、Wnt1、β-catenin和 LRP5 mRNA表達增高，DKK1mRNA表達降低（P＜0.05，表 2、表 3）。

Fig.1 Pathological changes of articular cartilage in knee joints（HE×200）

Tab.2 Effects of Youguipill on expressions of DKK1、W1SP1 and Wnt1mRNA in cartilage tissue（，n＝10）

Tab.2 Effects of Youguipill on expressions of DKK1、W1SP1 and Wnt1mRNA in cartilage tissue（，n＝10）

*P＜0.05 vs sham group；＃P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs glucosamine sulfate group

Group DKK1 WISP1 Wnt1 Sham 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 Model 0.46±0.18* 5.43±0.97* 4.77±0.37*Glucosamine sulfate 1.19±0.15＃ 1.80±0.51*＃ 3.24±0.85*＃Youguipill low-dose 0.42±0.03*△ 4.99±0.75*△ 4.48±0.84*△Youguipillmiddle-dose 0.59±0.11△ 4.22±0.40*△ 4.10±0.92*△Youguipill high-dose 0.90±0.14＃ 1.68±0.79*＃ 1.82±0.61*＃

Tab.3 Effects of Yougui pill on expressions ofβ-catenin、LRP5 mRNA in cartilage tissue（，n＝10）

Tab.3 Effects of Yougui pill on expressions ofβ-catenin、LRP5 mRNA in cartilage tissue（，n＝10）

*P＜0.05 vs sham group；＃P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs glucosamine sulfate group

Group β-catenin LRP5 Sham 1.00±0.00 1.00±0.00 Model 3.53±0.99* 4.34±0.89*Glucosamine sulfate 2.19±0.69*＃ 2.72±0.96*＃Youguipill low-dose 3.41±0.19*△ 4.29±0.64*△Youguipillmiddle-dose 3.33±0.75*△ 3.49±0.34*△Youguipill high-dose 2.08±0.85*＃ 2.14±1.11*＃

2.4 右歸丸對軟骨組織 DKK1、W ISP1、Wnt1、βcatenin和LRP5蛋白質(zhì)表達的影響

與假手術(shù)組比較，模型組、右歸丸低、中劑量組大鼠軟骨組織 WISP1、Wnt1、β-catenin和 LRP5蛋白質(zhì)表達增高，DKK1蛋白質(zhì)表達降低（P＜0.05）；與模型組比較，右歸丸高劑量組和硫酸氨基葡萄糖組大鼠 WISP1、Wnt1、β-catenin和 LRP5蛋白質(zhì)表達降低，DKK1蛋白質(zhì)表達升高（P＜0.05）；與硫酸氨基葡萄糖組比較，右歸丸低、中劑量組WISP1、Wnt1、βcatenin和LRP5蛋白質(zhì)表達增高，DKK1蛋白質(zhì)表達降低（P＜0.05，表 4、表 5，圖 2-6）。

Tab.4 Effects of Yougui pill on protein expressions of DKK1，WISP1 and Wnt1 in cartilage tissue（，n＝10）

Tab.4 Effects of Yougui pill on protein expressions of DKK1，WISP1 and Wnt1 in cartilage tissue（，n＝10）

*P＜0.05 vs sham group；＃P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs glucosamine sulfate group

Group DKK1 WISP1 Wnt1 Sham 0.89±0.17 0.96±0.06 0.91±0.24 Model 0.43±0.03*2.10±0.15*2.05±0.34*Glucosamine sulfate 0.99±0.18＃ 1.08±0.11＃ 1.42±0.45＃Youguipill low-dose 0.45±0.04*△ 1.87±0.36*△ 3.17±0.41*△Youguipillmiddle-dose 0.51±0.07*△ 1.69±0.15*△ 2.53±0.69*△Youguipill high-dose 0.76±0.05＃ 0.96±0.05＃ 1.00±0.24＃

Tab.5 Effects of Yougui pill on protein expressions ofβ-catenin and LRP5 in cartilage tissue（，n＝10）

Tab.5 Effects of Yougui pill on protein expressions ofβ-catenin and LRP5 in cartilage tissue（，n＝10）

*P＜0.05 vs sham group；＃P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs glucosamine sulfate group

Group β-catenin LRP5 Sham 0.78±0.11 1.00±0.24 Model 1.57±0.15* 3.49±0.21*Glucosamine sulfate 0.78±0.07＃ 1.00±0.04＃Youguipill low-dose 1.19±0.44*△ 2.60±0.64*△Youguipillmiddle-dose 1.28±0.49*△ 1.89±0.22*△Youguipill high-dose 0.71±0.11＃ 0.79±0.04＃

Fig.2 Effects of Youguipill on DKK1 protein expression in cartilage tissue

Fig.3 Effectsof YouguipillonWISP1 protein expression in cartilage tissue

Fig.4 Effects of Yougui pill onWnt1 protein expression in cartilage tissue

Fig．5 Effectof Youguipillonβ-catenin protein expression in cartilage tissue

Fig.6 Effects of Yougui pill on LRP5 protein expression in cartilage tissue

3 討論

近年研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典Wnt信號通路與胚胎軟骨發(fā)育，出生后軟骨發(fā)生、成骨細胞和破骨細胞生成、軟骨內(nèi)成骨、骨重塑、骨折修復等密切相關(guān)，成為治療KOA的潛在靶點［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，KOA模型組大鼠軟骨組織DKK1 mRNA和蛋白質(zhì)表達降低，WISP1、Wnt1、β-catenin和 LRP5 mRNA和蛋白質(zhì)表達增高，與以往的研究一致［12-16］。由此推測 Wnt／βcatenin信號通路被異常激活參與了KOA發(fā)生、發(fā)展，是導致KOA軟骨破壞、滑膜損傷的主要原因。大劑量右歸丸干預后，能夠有效地促進KOA模型組大鼠DKK1mRNA和蛋白表達，有效地抑制WISP1、Wnt1、β-catenin和 LRP5 mRNA和蛋白質(zhì)表達。推測，右歸丸可能是通過抑制經(jīng)典Wnt／β-catenin信號通路來達到治療KOA的目的。

另外，本實驗病理形態(tài)學及Mankins評分結(jié)果顯示，模型組大鼠軟骨組織大量脫落，軟骨細胞數(shù)目增多，空泡變大，排列紊亂，出現(xiàn)簇聚現(xiàn)象，而右歸丸高劑量組大鼠軟骨細胞排列整齊，分布均勻，鈣化層軟骨細胞輕度成簇，潮線尚完整。模型組大鼠Mankin評分顯著高于假手術(shù)組，這與周穎燕等人的研究一致［17］。模型組及各干預組大鼠Mankin評分均高于假手術(shù)組，硫酸氨基萄葡糖組與右歸丸高劑量組大鼠Markin評分均低于模型組（P＜0.05），提示硫酸氨基萄葡糖與高劑量右歸丸治療膝骨性關(guān)節(jié)炎有效。

總之，高劑量右歸丸能較好地減輕KOA的關(guān)節(jié)軟骨病變，其具體的機制可能是通過抑制經(jīng)典Wnt／β-catenin信號通路中的 WISP1、Wnt1、β-catenin和LRP5關(guān)鍵因子來實現(xiàn)的。

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