賀智慧，邵立群，宣麗穎，王春貴，魏成喜，王 羽△，趙 明△

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，通遼028000；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院，通遼028000）

阿霉素（adriamycin，ADR）是一種廣譜蒽環(huán)類抗腫瘤藥物，由于ADR與心肌組織具有非常高的親和力，具有嚴(yán)重的心臟毒性，可導(dǎo)致阿霉素性心肌病，其特點(diǎn)為心室擴(kuò)大并伴有心肌重構(gòu)及收縮功能降低［1］。阿霉素性心肌病因心肌病變導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡及心肌纖維化等因素易誘發(fā)室性心律失常，引起患者心源性暈厥、猝死［2］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）是一種亞細(xì)胞器，主要功能是合成蛋白質(zhì)并使合成的蛋白質(zhì)由一級(jí)結(jié)構(gòu)變成具有生理功能的空間結(jié)構(gòu)場(chǎng)所。當(dāng)各種原因?qū)е聝?nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡時(shí)，出現(xiàn)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)異常聚集并引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性蛋白分泌增加，識(shí)別錯(cuò)誤折疊蛋白，通過蛋白酶體將其降解，上述一系列反應(yīng)過程即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)（endoplasmic reticulum stress，ERS）［3］。文獻(xiàn)報(bào)道內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與心肌重構(gòu)及心肌病密切相關(guān)［4］，而阿霉素性心肌病主要病理學(xué)變化就是發(fā)生心肌細(xì)胞凋亡及纖維化等心肌重塑改變。黃芪是我國傳統(tǒng)中藥之一（系豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根），為常用補(bǔ)氣藥物，具有顯著的益氣強(qiáng)心作用。本團(tuán)隊(duì)在前期工作中發(fā)現(xiàn)黃芪注射液對(duì)阿霉素所致的心肌損傷具有保護(hù)作用［5］，但具體機(jī)制尚未明確。本研究擬用Wistar大鼠作為研究對(duì)象，建立阿霉素性心肌病動(dòng)物模型，予以黃芪注射液干預(yù)治療，探討其對(duì)阿霉素心肌病保護(hù)的機(jī)制，為黃芪注射液臨床有效治療阿霉素性心肌病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物藥品與儀器

Wistar大鼠購自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心，許可證號(hào)：scxk（吉）2011-0004。阿霉素（深圳萬東藥業(yè)）。CX43及p-CX43抗體購于Wanleibio公司。黃芪注射液（成都地奧九泓制藥廠），國藥準(zhǔn)字Z51021776，規(guī)格：10 ml／支。光學(xué)顯微鏡（Olympus）和H-600型電子顯微鏡（日立，日本）。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及擴(kuò)張型心肌病大鼠模型制備

36只Wistar雄性大鼠，體重200～230 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)后隨機(jī)分為3組（n＝12）：對(duì)照組、阿霉素心肌病組及黃芪注射液組，對(duì)照組腹腔注射0.9%Nacl（10ml／kg）；阿霉素心肌病組腹腔注射阿霉素2 mg／kg。黃芪注射液組在每次注射同等劑量阿霉素同時(shí)，注射黃芪注射液10 g／kg。各組每周注射一次，共三周）。

1.3 心臟彩超檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)第7周末，用VIVID E9彩超機(jī)對(duì)3組大鼠行多普勒心臟超聲檢測(cè)心功能，以左室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD）、左室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end-systolic diameter，LVESD）及左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）數(shù)值來確定阿霉素心肌病模型是否造模成功及黃芪注射液治療效果。

1.4 病理取材及切片制作

心臟超聲心動(dòng)圖檢查后，立即處死大鼠，在無菌狀態(tài)下剪開大鼠左肋，去除心包后暴露心臟，取出心臟。將左心室肌組織放入4%多聚甲醛溶液中固定，經(jīng)乙醇脫水，石蠟包埋，切片，心肌切片脫蠟、二甲苯透明，行HE、masson染色，于光鏡下觀察病理變化。同時(shí)將中、下1／3心臟組織加于2.5%戊二醛溶液中固定，PBS溶液漂洗，1%鋨酸固定，再次用PBS溶液漂洗，梯度乙醇脫水，Epon812環(huán)氧樹脂浸透包埋，超薄切片成70 nm切片，醋酸鈾檸檬酸鉛染色，于透射電鏡下觀察拍片并存檔。

1.5 TUNEL法檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞凋亡

采用標(biāo)準(zhǔn)TUNEL實(shí)驗(yàn)步驟，檢測(cè)各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況。

1.6 免疫組化檢測(cè)各組大鼠心肌細(xì)胞CX43及p-CX43表達(dá)

各組大鼠心肌組織用4%多聚甲醛溶液固定，脫水，石蠟包埋，切片后進(jìn)行免疫組化染色。加入抗CX43及抗 p-CX43抗體，37℃作用 2 h，PBS洗滌 3次。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，37℃作用1 h后，PBS洗滌 3次。加入 3，3’-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，顯色終止后，顯微鏡下觀察染色后的組織，并采集圖像分析。

1.7 Real-time PCR檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞 Grp78、ATF-4及CHOPmRNA表達(dá)

引物信息：Grp78 Forward 5’-3’ CAGCCAACTGTAACAATCAA；Grp78 Reverse 5’-3’ CTGTCACTCGGAGAATACCA；ATF-4 Forward 5’-3’ CTG-TATGAGCCCAGAGTCCT；ATF-4 Reverse 5’-3’GCTGCTGTCTTGTTTTGCTC；CHOP Forward 5’-3’ATGTTGAAGATGAGCGGGTG；CHOP Reverse 5’-3’CCGTCTCCAAGGTGAAAGGC；β-actin Forward 5’-3’ GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTAGC；β-actin Reverse 5’-3’ GGCCGGACTCATCGTACTCCTGCTT

經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)real-time PCR實(shí)驗(yàn)步驟，檢測(cè)3組大鼠心肌細(xì)胞 Grp78、ATF-4及 CHOPmRNA表達(dá)，利用2-△△CT方法分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均值 ±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用SSPS 11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組間均數(shù)比較采用 t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 黃芪注射液對(duì)大鼠精神、飲食、活動(dòng)、毛色及死亡數(shù)量的影響

對(duì)照組大鼠毛發(fā)光亮，體質(zhì)量隨時(shí)間增加。ADR組大鼠毛發(fā)灰暗，躁動(dòng)不安，不喜飲食，心臟增大；黃芪注射液組大鼠毛發(fā)略灰暗。3組大鼠在飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)過程中均未出現(xiàn)死亡。

2.2 黃芪注射液對(duì)大鼠心臟彩超的影響

如圖1、表1所示，對(duì)照組大鼠心臟彩超未見明顯異常。與對(duì)照組比較，ADR組大鼠 LVEDD、LVESD明顯增大，LVEF明顯減少（P均 ＜0.01），說明造模成功。黃芪注射液組大鼠LVEDD、LVESD較ADR組大鼠明顯減小，LVEF明顯增加（P均 ＜0.01）。

Fig.1 Heart color Doppler ultrasound images of each group

2.3 黃芪注射液對(duì)大鼠心肌結(jié)構(gòu)的影響

HE染色顯示：ADR組大鼠出現(xiàn)心肌纖維排列紊亂，心肌纖維間質(zhì)水腫，大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。黃芪注射液組大鼠心肌紊亂及間質(zhì)水腫明顯輕于ADR組（圖2）。Masson染色時(shí)，心肌纖維和紅細(xì)胞呈紅色，而膠原纖維呈藍(lán)色。Masson染色顯示，ADR組大鼠心肌纖維化嚴(yán)重；黃芪注射液組大鼠心肌纖維化輕于ADR組（圖3）。電鏡觀察顯示：ADR組大鼠心肌顯示有肌纖維溶解破壞、線粒體極度腫脹、破壞，呈空泡樣。黃芪注射液組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷較ADR組明顯減輕，線粒體空泡明顯減少（圖4）。

Tab.1 Ventricular structure in each group rats with dilated cardiomyopathy（，n＝12）

LVEDD：Left ventricular end-diastolic diameter；LVESD：Left ventricular end-systolic diameter；LVEF：Left ventricular ejection fraction**P＜0.01 vs control group； ＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs ADR group

Group LVEDD（mm） LVESD（mm） LVEF（%）Control 4.63±0.37 2.49±0.24 80.0±4.7 ADR 6.24±0.31**3.54±0.33**69.0±4.2**Astragalus 5.31±0.24＃＃ 2.97±0.41＃＃ 76.0±3.9＃

Fig.2 The rat cardiomyocyte HE staining

Fig.3 The rat cardiomyocyte Masson staining

Fig.4 Transmission electronic microscope image of rat cardiomyocyte

2.4 黃芪注射液對(duì)大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

如圖5所示：與對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞凋亡（4.12±0.98）%比較，ADR組大鼠心肌細(xì)胞凋亡（25.23±5.38）%明顯增加（P＜0.01）；與 ADR組大鼠心肌細(xì)胞凋亡比較，黃芪注射液組大鼠心肌細(xì)胞凋亡（15.71±5.76）%明顯減低（P＜0.01）。

Fig.5 Apoptosis of rat cardiomyocyte of each group

2.5 黃芪注射液對(duì)大鼠心肌細(xì)胞CX43及p-CX43表達(dá)的影響

如圖6所示：與對(duì)照組大鼠（21.1±1.07）%比較，ADR組大鼠心肌細(xì)胞 CX43表達(dá)（1.15±0.51）%明顯減少，與ADR組大鼠比較，黃芪注射液組大鼠心肌細(xì)胞 CX43表達(dá)（10.37±0.78）%明顯增加。與對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞 p-CX43表達(dá)（0.94±0.11）%比較，ADR組大鼠心肌細(xì)胞 p-CX43表達(dá)（9.77±0.69）%明顯增加；與ADR組大鼠比較，黃芪注射液組大鼠心肌細(xì)胞 p-CX43表達(dá)（4.18±0.51）%明顯減少。

Fig.6 CX43 and p-CX43 immunohistochemistry staining of rat cardiomyocyte in each group

2.6 黃芪注射液對(duì)大鼠心肌細(xì)胞Grp78、ATF-4及CHOPmRNA表達(dá)的影響

3組大鼠心肌細(xì)胞Grp78、ATF-4及CHOP的擴(kuò)增曲線及溶解曲線如圖7所示。

與對(duì)照組比較，ADR組大鼠心肌細(xì)胞Grp78，ATF-4和CHOPmRNA表達(dá)明顯增多（P＜0.01）；與ADR組大鼠比較，黃芪注射液組大鼠心肌細(xì)胞Grp78，ATF-4和 CHOP mRNA表達(dá)明顯減少（P＜0.01，表 2）。

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)正確折疊功能異常，可導(dǎo)致誤折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)異常聚集及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性蛋白分泌增加，識(shí)別錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)，并通過蛋白酶體將其降解，上述一系列反應(yīng)過程即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)（endoplasmic reticulum stress，ERS）［6］。VMC小鼠及柯莎奇 B3（CVB3）病毒感染心肌細(xì)胞可引發(fā)ERS［7］。本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，阿霉素可引起心肌細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路引發(fā)心肌細(xì)胞凋亡［8］。凋亡使工作心肌細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量減少，導(dǎo)致心肌收縮力下降，從而發(fā)生心力衰竭［9］。同時(shí)，心肌細(xì)胞凋亡可導(dǎo)致心臟成纖維細(xì)胞增生、轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，增加細(xì)胞外基質(zhì)沉積，導(dǎo)致心臟纖維化引發(fā)心肌重構(gòu)［10］。

Tab.2 The mRNA expression of Grp78，ATF-4 and CHOP in rats’heartof each group

Fig.7 Amplification and solubility curve of Grp78，ATF-4，CHOP real-time PCR

中藥材黃芪為豆科草本植物蒙古黃芪的根，具有補(bǔ)氣固表、利水退腫功效［11］，作為藥物使用已有兩千多年的歷史。黃芪注射液是從黃芪中提取的有效成分，臨床應(yīng)用廣泛，可用于治療心氣虛損、血脈瘀阻之病毒性心肌炎、心功能不全等疾?。?］。

本研究發(fā)現(xiàn)，阿霉素組大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激伴侶蛋白 Grp78（glucose-regulated protein 78）以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡信號(hào)通路因子ATF-4（activating transcription factor 4）、CHOP（C／EBP homologous protein）mRNA表達(dá)明顯增多，并出現(xiàn)嚴(yán)重心肌細(xì)胞凋亡；而黃芪注射液組大鼠心肌細(xì)胞凋亡明顯減少，同時(shí)伴有Grp78、ATF-4、CHOPmRNA表達(dá)減少。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，阿霉素可引起心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡信號(hào)通路Grp78→ATF-4→CHOP介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡；黃芪注射液減少阿霉素大鼠心肌細(xì)胞凋亡機(jī)制是緩解心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡信號(hào)通路因子活化。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黃芪注射液能夠增加阿霉素大鼠心肌細(xì)胞Cx43（connexin 43）表達(dá)，減少p-Cx43表達(dá)。文獻(xiàn)報(bào)道：Cx43是構(gòu)成縫隙連接通道（gap junction，GJ）的主要成分，Cx43磷酸化使GJ通道關(guān)閉，而Cx43去磷酸化則促使GJ通道開放［12］。GJ通道關(guān)閉使得心肌細(xì)胞間電傳導(dǎo)出現(xiàn)障礙，是產(chǎn)生心律失常的重要原因。研究結(jié)果表明，黃芪注射液能增加Cx43表達(dá)，抑制p-Cx43表達(dá)，具有抗阿霉素心肌病所致的心律失常作用，其作用機(jī)制可能與抑制阿霉素誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而致心肌細(xì)胞凋亡及縫隙連接蛋白磷酸化有關(guān)。據(jù)此推測(cè)，未來黃芪注射液可能被廣泛用于阿霉素心肌病的臨床治療。

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