李燁儀，尚 曼，張琨瑋，韋 蘇，劉 超，祝 倩，趙俊玉，吳艷娜，宋君秋，劉艷霞

（天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，天津300070）

微囊泡（microvesicles，MVs）是細(xì)胞在激活或凋亡等多種病理?xiàng)l件下分泌的直徑在100～1000 nm的微小囊泡。MVs具有雙層膜結(jié)構(gòu)，攜帶來源于母細(xì)胞的多種生物活性物質(zhì)，如組織因子、粘附因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、DNA、RNA等，并將其轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞中，介導(dǎo)一系列生物學(xué)效應(yīng)。研究表明，動(dòng)脈粥樣硬化、急性心肌缺血等心血管系統(tǒng)疾病患者循環(huán)血中 MVs的水平顯著升高［1，2］。在心肌缺血 ／再灌注（ischemia／reperfusion，I／R）損傷動(dòng)物模型中，內(nèi)皮細(xì)胞受損釋放的MVs攜帶大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），在血管內(nèi)皮功能障礙和心肌細(xì)胞損傷中發(fā)揮重要作用［3］。I／R損傷可以導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞ROS過量生成，ROS累積反過來也加重內(nèi)皮功能障礙。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中，采用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）缺氧／復(fù)氧（hypoxia／reoxygenation，H／R）模型模擬體內(nèi)I／R損傷，成功誘導(dǎo) HUVECs分泌微囊泡（H／REMVs），后者對(duì)H9c2心肌細(xì)胞產(chǎn)生顯著的促凋亡作用［4］，并通過增強(qiáng)氧化應(yīng)激反應(yīng)抑制大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)的舒張功能［5］。

傳統(tǒng)中藥黃芪可用于治療多種心血管系統(tǒng)疾病，黃芪總皂苷是黃芪的主要成分。黃芪苷Ⅳ（Astragaloside IV，AST）是從黃芪總皂苷中分離得到的主要有效成分，相對(duì)于其他成分來說，AST含量較高、水溶性較好、活性較強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)，AST可以改善心臟收縮和舒張功能，松弛血管平滑肌，對(duì)缺血或缺氧損傷的心肌具有良好的保護(hù)作用［6］。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，AST通過減少ROS產(chǎn)生，可減輕過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）導(dǎo)致的 H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷［7］。AST也可以調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能［8］。

本實(shí)驗(yàn)采用H／R誘導(dǎo)HUVECs釋放的微囊泡（H／R-EMVs）處理大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)，造成其舒張功能損傷，探究AST對(duì)舒張功能的影響及相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雄性 Wistar大鼠，體重 240～260 g，清潔級(jí)，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所提供。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）：EA.hy926，購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。黃芪苷Ⅳ（AST，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）：購自復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院。BCA法蛋白質(zhì)定量及NO測(cè)定試劑盒：購自碧云天生物技術(shù)有限公司。Anti-p-eNOS、Anti-p-ERK1／2及 Anti-ERK1／2：購 自Abcam公司；Anti-Akt、Anti-p-Akt及 Anti-eNOS：購自Cell Signaling Technology公司。

1.2 H／R誘導(dǎo) HUVECs釋放 MVs

HUVECs懸液 1×105cells／ml，接種于 6孔板中，每孔2ml，5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)24 h。細(xì)胞生長融合至70%～80%時(shí)，棄去培養(yǎng)液，每孔加入2 ml細(xì)胞缺氧培養(yǎng)緩沖液（NaH2PO40.9 mmol／L，NaHCO36.0 mmol／L，CaCl21.0 mmol／L，MgSO41.2 mmol／L，NaCl 98.5 mmol／L，KCl 10.0 mmol／L，HEPES 20.0 mmol／L，乳酸鈉 40.0mmol／L，pH 6.2）。將培養(yǎng)板置于缺氧裝置中（充入95%N2-5%CO2混合氣體，流量20 L／min，充氣15 min后密閉該裝置），將缺氧裝置放入37℃氮?dú)夂銣胤跸渲?，缺氧處?2 h。隨后，將培養(yǎng)板置5%CO2、37℃普通培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。

1.3 H／R-EMVs的提取、蛋白質(zhì)定量與透射電鏡觀察

H／R處理 HUVECs后，收集培養(yǎng)液，4℃、2 700 g離心20 min，去除細(xì)胞碎片；取上清，4℃、33 000 r／min超速離心 148 min，棄上清，沉淀即為 H／REMVs。用 D-Hank’s溶液重懸 H／R-EMVs，BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｈ?0μl H／R-EMVs懸液滴于載樣銅網(wǎng)上，室溫條件下放置2min，待H／R-EMVs懸液充分浸入銅網(wǎng)后，用濾紙吸去多余懸液。滴入2%磷鎢酸染色液40μl，室溫靜置2 min。白熾燈照射載樣銅網(wǎng)使之干燥后，在透射電鏡放大25.0 k倍下觀察 H／R-EMVs形態(tài)。

1.4 內(nèi)皮完整的大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)的制備及實(shí)驗(yàn)分組

處死大鼠，剪開胸腔迅速取下胸主動(dòng)脈，置4℃Krebs液（NaCl 118 mmol／L，KCl 4.7 mmol／L，KH2PO41.2 mmol／L，MgSO4·7H2O 1.2 mmol／L，CaCl2·2H2O 2.5 mmol／L，NaHCO325 mmol／L和葡萄糖 10 mmol／L）中，剔除結(jié)締組織后剪成3～4 mm寬的血管環(huán)，置含10%FBS的DMEM中孵育。實(shí)驗(yàn)分為6組：H／R-EMVs組，在孵育胸主動(dòng)脈環(huán)的培養(yǎng)液中加入H／R-EMVs，使其終濃度為 10μg／ml；不同劑量的 AST組分別采用 10、20、40、60 mg／L AST與 10μg／ml H／R-EMVs共同孵育胸主動(dòng)脈環(huán)；對(duì)照組給予等體積的D-Hank’s溶液。孵育時(shí)間為4 h，每組各測(cè)定5個(gè)血管環(huán)。各組在37℃，5%CO2條件下孵育4 h，隨后將血管環(huán)懸掛于預(yù)置10ml Krebs液的浴槽中，37℃、充入95%O2-5%CO2氣體，連接離體組織灌流裝置和張力傳感器。

1.5 離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)舒張功能檢測(cè)

胸主動(dòng)脈環(huán)在2.0 g的預(yù)負(fù)荷張力下平衡60 min。以 10-6mol／L苯腎上腺素（phenylephrine，PE）激發(fā)最大收縮，待收縮幅度穩(wěn)定后，累積加入終濃度分別為 10-9～10-6mol／L的乙酰膽堿（acetylcholine，ACh），檢測(cè)血管舒張功能。

1.6 大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)NO含量的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，使用4℃生理鹽水沖洗大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)，剪碎組織置冰上勻漿，勻漿液在4℃、12 000 r／min離心10 min。使用Griess試劑測(cè)定上清液中NO含量。

1.7 Western blot檢測(cè) p-eNOS、t-eNOS、p-Akt、t-Akt、p-ERK1／2與 ERK1／2

將大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)剪碎并勻漿，用RIPA裂解液冰上裂解，4℃、12 000 g離心10 min提取蛋白，BCA法定量蛋白質(zhì)。取100μg蛋白質(zhì)在10%分離膠上電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。分別加 Anti-eNOS及 Anti-p-eNOS（1∶500），Anti-Akt及 Anti-p-Akt，Anti-ERK1／2（1∶1 000）及 Anti-p-ERK1／2（1∶2 000），4℃孵育過夜。TBST洗膜 3次，將PVDF膜與IgG抗體（1∶1 000）震蕩孵育2 h。蛋白印跡通過化學(xué)發(fā)光試劑發(fā)出熒光，Quantity One軟件分析條帶的灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）來表示各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，Logit法計(jì)算不同組ACh誘發(fā)舒張的半數(shù)有效劑量及其95%的可信限（EC50±L95）。使用 SPSS 18.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析及Bonferroni post hoc法進(jìn)行組間比較。

2 結(jié)果

2.1 H／R-EMVs的蛋白定量與形態(tài)鑒定

H／R-EMVs蛋白質(zhì)含量為（0.31±0.02）μg／μl。在TEM下放大 25.0 k倍，可見 H／R-EMVs呈直徑0.1～1μm的膜性囊泡結(jié)構(gòu)，外形為圓形或橢圓形，表面有完整的包膜，外部深染區(qū)為脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，內(nèi)部呈現(xiàn)為均一淺染區(qū)，囊泡內(nèi)部未見細(xì)胞器結(jié)構(gòu)（圖1）。

Fig.1 Characteristics of H／R-EMVs（negative staining×25.0 k）H／R-EMVswere observed by the transmission electronmicroscope

2.2 AST對(duì)H／R-EMVs損傷的離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)舒張功能的影響

與對(duì)照組胸主動(dòng)脈環(huán)舒張率（99.67% ±5.57%）相比，H／R-EMVs使胸主動(dòng)脈環(huán)舒張率（66.07%±1.78%）顯著降低（P＜0.01）。20、40和60mg／L的AST呈劑量依賴性地減輕H／R-EMVs對(duì)離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)舒張功能的損傷，最大舒張率分別為：73.92% ±0.61%，85.95% ±2.21%，95.51%±4.46%，與 H／R-EMVs組差異顯著（P＜0.01）。10mg／L AST對(duì)離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)舒張功能無明顯影響（64.93%±0.91%，圖 2）。

比較不同組ACh誘發(fā)大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)舒張的EC50±L95，對(duì)照組（0.019±0.006）μmol／L與 H／REMVs組（0.249±0.095）μmol／L有顯著差異（P＜0.01）。與 H／R-EMVs組相比，20、40和 60mg／L AST組ACh誘發(fā)舒張的 EC50±L95逐漸降低（分別為0.119±0.033，0.037±0.004，0.020±0.005μmol／L，P＜0.01），而 10mg／L AST組（0.242±0.076）μmol／L與H／R-EMVs組無明顯差別。

Fig.2 Effects of AST on endothelium-dependent relaxation of thoracic aortic rings of rats impaired by 10μg／ml H／R-EMVs（，n＝5）

2.3 AST對(duì)H／R-EMVs處理的離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)NO含量的影響

與對(duì)照組離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)NO含量（84.02±5.12）μmol／L相比，H／R-EMVs組 NO含量（56.17±4.31）μmol／L顯著降低（P＜0.01）。與 H／REMVs組相比，AST 20、40和 60 mg／L組 NO含量（分別為 62.11±3.91，73.37±2.99，81.91±4.15 μmol／L）顯著增加，（P＜0.05，P＜0.01），并呈現(xiàn)出劑量依賴性相關(guān)。AST 10 mg／L組的 NO含量（54.78±3.11）μmol／L無明顯改變。

2.4 AST對(duì)H／R-EMVs損傷的離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán) p-eNOS、t-eNOS、p-Akt、t-Akt、p-ERK 1／2 及ERK1／2的影響

與對(duì)照組相比，H／R-EMVs能夠下調(diào)離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán) p-eNOS、p-Akt和 p-ERK1／2磷酸化水平，而不影響 t-eNOS、t-Akt和 ERK1／2的蛋白質(zhì)水平。與 H／R-EMVs組相比，40 mg／L AST組對(duì) teNOS，t-Akt和 ERK1／2無顯著影響，但使 p-eNOS，p-Akt和 p-ERK1／2磷酸化水平顯著上升（P＜0.01）；使 p-eNOS／t-eNOS，p-Akt／t-Akt和 p-ERK1／2／ERK1／2的比值顯著增加（P＜0.01，圖 3，表 1）。

Fig.3 Effects of AST on expressions of p-eNOS，t-eNOS，p-Akt，t-Akt，p-ERK1／2 and ERK1／2 in thoracic aortic rings of rats impaired by H／R-EMVs

3 討論

EMVs與內(nèi)皮功能障礙的發(fā)生和發(fā)展過程密切相關(guān)［9］。心肌梗死病人內(nèi)皮功能紊亂的發(fā)生與其循環(huán)血中 EMVs數(shù)量的上升有關(guān)［1］。心肌 I／R損傷時(shí)，EMVs的大量產(chǎn)生可引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及功能障礙［10］。本研究采用體外培養(yǎng)的 HUVECs建立 H／R模型，模擬 I／R損傷，從而釋放 H／R-EMVs。Pan等［11］實(shí)驗(yàn)室使用兩步離心法可成功提取MVs，本實(shí)驗(yàn)同樣采用超速離心法分離出H／R-EMVs，經(jīng)透射電鏡檢測(cè)為直徑100～1000 nm之間的囊泡結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)室早期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，H／R-EMVs可損傷大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)的舒張功能［5］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣證實(shí)該結(jié)論。

心肌I／R發(fā)生時(shí)，NO的釋放減少，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能紊亂［12］。NO的下調(diào)可引起心肌梗塞小鼠的血管內(nèi)皮功能損傷［13］。eNOS是血管系統(tǒng)中NO的主要合酶。在心肌I／R損傷的病理研究中發(fā)現(xiàn)，通過抑制 eNOS的蛋白質(zhì)水平削弱 NO的釋放［14］。AST對(duì)血管內(nèi)皮功能具有保護(hù)作用［6］。Chen等［15］在游離脂肪酸所致的胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷研究中發(fā)現(xiàn)，AST可激活eNOS，提高NO水平，恢復(fù)血管舒張，改善血管內(nèi)皮功能。AST使肥胖模型大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)舒張率顯著提高，血管內(nèi)皮功能明顯改善［6］。本研究表明，AST可以增加受 H／R-EMVs作用降低的大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)NO的含量，上調(diào)p-eNOS磷酸化水平，提示AST對(duì)血管內(nèi)皮的保護(hù)作用可能是由于促進(jìn)eNOS活化而增加NO的釋放。

Akt／eNOS是介導(dǎo) NO水平的經(jīng)典信號(hào)途徑。Akt是eNOS的上游靶蛋白，其對(duì)心肌I／R損傷的保護(hù)作用與活化Akt，促進(jìn)eNOS的活化有關(guān)［16］。調(diào)節(jié)Akt信號(hào)通路，激活下游底物，上調(diào)p-eNOS磷酸化水平進(jìn)而影響NO的釋放，對(duì)血管內(nèi)皮的正常功能起保護(hù)作用［17］。AST能夠增加H／R損傷時(shí)心肌細(xì)胞Akt蛋白的磷酸化。AST通過調(diào)節(jié)p-Akt磷酸化水平發(fā)揮對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用［18］。ERK1／2是與氧化應(yīng)激相關(guān)的重要信號(hào)通路。缺血預(yù)適應(yīng)研究發(fā)現(xiàn)，在ROS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞低氧預(yù)適應(yīng)模型中，通過ERK1／2途徑可啟動(dòng)心肌缺氧預(yù)處理的保護(hù)效應(yīng)［19］。本實(shí)驗(yàn)室早期研究發(fā)現(xiàn)，AST通過激活ERK1／2信號(hào)通路，可減輕H2O2引起的H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷［7］。在乳鼠心肌細(xì)胞I／R損傷與維持血管內(nèi)皮功能的相關(guān)研究中均發(fā)現(xiàn)，AST保護(hù)作用的機(jī)制涉及 ERK1／2信號(hào)途徑［20，21］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AST可使受 H／R-EMVs處理的胸主動(dòng)脈環(huán)p-Akt磷酸化水平顯著提高，增加 p-ERK1／2／ERK1／2比值，表明 AST對(duì) H／R-EMVs損傷的胸主動(dòng)脈環(huán)的保護(hù)作用，與調(diào)節(jié)Akt／eNOS與ERK1／2兩條重要細(xì)胞信號(hào)通路相關(guān)。

Tab.1 Effects of AST on p-eNOS／t-eNOS，p-Akt／t-Akt and p-ERK1／2／ERK1／2 expressions in thoracic aortic rings of rats impaired by H／R-EMVs（，n＝5）

Tab.1 Effects of AST on p-eNOS／t-eNOS，p-Akt／t-Akt and p-ERK1／2／ERK1／2 expressions in thoracic aortic rings of rats impaired by H／R-EMVs（，n＝5）

p-eNOS：Phosphorylated endothelial NO synthase；t-eNOS：Total endothelial NO synthase；p-Akt：Phosphorylated serine／threonine kinase；t-Akt：Total serine／threonine kinase；p-ERK1／2：Phosphorylated extracellular regulated protein kinases；ERK1／2：Extracellular regulated protein kinases**P＜0.01 vs control； ＃＃P＜0.01 vs H／R-EMVs

Group p-eNOS／t-eNOS p-Akt／t-Akt p-ERK1／2／ERK1／2 Control 0.8527±0.0165 0.8180±0.0194 0.8639±0.0219 H／R-EMVs 0.4634±0.0114** 0.4086±0.0055** 0.3459±0.0139**AST 40mg／L+H／R-EMVs 0.6528±0.0185**＃＃ 0.6891±0.0188**＃＃ 0.7177±0.0582**＃＃

本實(shí)驗(yàn)建立體外H／R模型模擬體內(nèi)I／R損傷，誘導(dǎo) HUVECs產(chǎn)生 H／R-EMVs，研究 AST對(duì) H／REMVs損傷的離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)舒張功能的作用及相關(guān)機(jī)制，首次證實(shí)20～60 mg／L AST能夠劑量依賴性地改善H／R-EMVs損傷的離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)舒張功能，其機(jī)制涉及NO含量的增加以及peNOS，p-Akt和 p-ERK1／2磷酸化水平的提高。

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