(浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物所，植物生理學(xué)與生物化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310058)

水稻無機(jī)磷含量是水稻磷吸收代謝能力的重要指標(biāo)。很多水稻磷相關(guān)基因突變體研究中都涉及無機(jī)磷含量的測(cè)定[1]，還有很多磷相關(guān)突變體就是通過葉片無機(jī)磷測(cè)定來篩選和基因定位[2,3]，因此水稻無機(jī)磷的測(cè)定是水稻磷相關(guān)途徑研究的重要方法，其準(zhǔn)確性將直接影響磷相關(guān)基因功能的研究。

目前水稻無機(jī)磷的測(cè)定主要采用吸光度法，樣品使用硫酸或者高氯酸消解后，采用孔雀綠法或者鉬藍(lán)法進(jìn)行測(cè)定[4，5]。這些方法步驟較多，需要分液稀釋后逐個(gè)加入反應(yīng)液，進(jìn)行顯色反應(yīng)，步驟繁瑣，耗時(shí)較多，尤其是樣品量很大時(shí)，準(zhǔn)確度也得不到保證。連續(xù)流動(dòng)分析儀是一種新型的分析儀器，自動(dòng)化分析，具有操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，目前已在不同領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。如連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定植物全氮、全磷、全鉀[6，7]；土壤中全氮、有效磷[8]；有機(jī)肥料中全氮[9]；稻米直鏈淀粉[10]；水質(zhì)分析[11，12]等，但使用連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定水稻無機(jī)磷含量尚未有報(bào)道。本研究應(yīng)用SAN++型連續(xù)流動(dòng)分析儀分析了不同水稻磷相關(guān)突變體的無機(jī)磷含量，并對(duì)儀器測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度進(jìn)行了分析，建立了一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 方法原理

水稻組織破碎后，用5M硫酸提取無機(jī)磷，在酸性條件下，磷酸根與鉬酸銨形成銻磷鉬混合雜多酸，在酒石酸銻鉀的催化下，被抗壞血酸還原成鉬藍(lán)，在880nm比色測(cè)定吸光度，利用鉬藍(lán)質(zhì)量濃度與吸光度呈正比定量測(cè)定。

1.2 材料與試劑

(1) 2mL離心管(國(guó)產(chǎn))，15 ml離心管(國(guó)產(chǎn))，小剪刀，10mL分液器，9mm定性濾紙；

(2) 連續(xù)流動(dòng)分析儀(荷蘭SKALAR)，荷蘭SKALAR公司生產(chǎn)，配置自動(dòng)進(jìn)樣器；球磨儀(萊馳)，德國(guó)萊馳生產(chǎn)；

(3) 5 M硫酸：650mL Milli-Q水中緩慢加入272mL 98%硫酸(分析純)，并不斷攪拌，冷卻后定容到1000mL；

(4) 無機(jī)磷測(cè)定反應(yīng)液：

反應(yīng)液I：800mL Milli-Q水緩慢加入25mL 濃硫酸(分析純)，并不斷攪拌，定容到1000mL；

反應(yīng)液P4：800mL Milli-Q水加入2mL FFD6(Skalar，cat.No：13909)，并不斷攪拌，定容到1000mL；

反應(yīng)液C2：800mL Milli-Q水緩慢加入40mL濃硫酸(分析純)，并不斷攪拌，定容到1000mL；

反應(yīng)液G：800mL Milli-Q水加入18 g抗壞血酸(分析純)，并不斷攪拌，加入20mL酒石酸銻鉀母液，定容到1000mL，4℃保存，最多保存2周，可根據(jù)測(cè)定工作量配置合適體積；

反應(yīng)液E：800mL Milli-Q水加入4.8 g鉬酸銨(分析純)，并不斷攪拌，加入40mL 酒石酸銻鉀母液，并加入2mLFFD6，定容到1000mL，4℃保存，最多保存2周，可根據(jù)測(cè)定工作量配置合適體積；

(5) 無機(jī)磷母液(1000 mg/L)：800mLMilli-Q水加入4.875 g NaH2PO4·2H2O(分析純)，并不斷攪拌，定容到1000mL；

(6) 酒石酸銻鉀母液：80mL Milli-Q水加入300 mg酒石酸銻鉀(分析純)，并不斷攪拌，定容到100mL，4℃保存；

1.3 植物材料

(1)水稻秧苗。野生型Nipponbare(Nip)種子露白后種到網(wǎng)紗板上，正常營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)21天，每3天換一次營(yíng)養(yǎng)液。

(2)取21天苗齡水稻倒二葉和根進(jìn)行測(cè)定。

1.4 樣品處理

(1)根據(jù)測(cè)定樣品數(shù)量，取國(guó)產(chǎn)2mL離心管并編號(hào)，每個(gè)離心管稱重并記錄。

(2)取水稻倒二葉或根，盡量剪碎，并放入稱重編號(hào)的2mL離心管中，取完樣品后，離心管和樣品一起稱重，并記錄，算出樣品質(zhì)量。樣品50～100 mg為宜。

(3)加入氧化鋯珠子(直徑5mm，淘寶有售，鐵珠子會(huì)被硫酸腐蝕)，并加入500μL5M硫酸，使用球磨儀24 frequency 1/s 頻率震動(dòng)研磨2min，磨碎葉片，直至成為均勻勻漿(可多次打樣)。

(4)使用分液器在每個(gè)磨碎的樣品中加入5mL Milli-Q水，并轉(zhuǎn)移到15mL離心管中，顛倒混勻。并使用500 μL 5 M硫酸和5mL Milli-Q水做2個(gè)空白對(duì)照。

(5)按照常規(guī)方法折疊9mm定性濾紙，將上述裂解液使用濾紙過濾到連續(xù)流動(dòng)分析儀自動(dòng)進(jìn)樣器配套的進(jìn)樣管中。

(6)過濾好后，按照順序放到自動(dòng)進(jìn)樣器相應(yīng)的位置上，2個(gè)空白首先放置。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液配置

使用100mL容量瓶，加入80mL反應(yīng)液I后，分別加入125 μL、250 μL、500 μL、1000 μL、2000 μL、3000 μL無機(jī)磷母液，用反應(yīng)液I稀釋至刻度，得到1.25 mg/L，2.5 mg/L，5 mg/L，10 mg/L，20 mg/L，30 mg/L梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.6 上機(jī)測(cè)定

(1)開機(jī)后，所有管路連接Milli-Q水，清洗管道5min后，5條進(jìn)液管道分別加到裝有反應(yīng)液I、P4、C2、G、E的反應(yīng)瓶中，進(jìn)行預(yù)反應(yīng)，此時(shí)打開“FlowAccess”軟件，設(shè)定到Total P測(cè)定的程序上，并打開讀數(shù)頁(yè)面，此時(shí)讀數(shù)應(yīng)在70～75萬之間。

(2)在流動(dòng)分析儀預(yù)熱過程中，分別將6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液倒入進(jìn)樣管中，體積至少3mL，否則會(huì)因?yàn)橐好嫣臀坏綐?biāo)液。同時(shí)按照測(cè)定樣本的數(shù)目，準(zhǔn)備好漂移校準(zhǔn)液(20 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液)，每測(cè)定10個(gè)樣品，測(cè)一次漂移校準(zhǔn)液，每次吸取750 μL左右，每個(gè)進(jìn)樣管吸5次。

(3)當(dāng)流動(dòng)分析儀進(jìn)樣系統(tǒng)各個(gè)管道流速均一，基線穩(wěn)定時(shí)，軟件中點(diǎn)擊Start按鈕，開始測(cè)定。

(4)全部測(cè)定完成后，根據(jù)測(cè)定結(jié)果和樣品質(zhì)量，按照式(1)計(jì)算出所測(cè)樣品中的無機(jī)磷濃度ω：

ω=(ρ×V) / (m×1000)

(1)

式中：

ρ—試樣溶液中的無機(jī)磷濃度，mg/L；

V—試樣溶液總體積，5.5mL；

m—稱取水稻葉片的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

按照標(biāo)準(zhǔn)配置標(biāo)準(zhǔn)溶液后，使用連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖和峰形圖見圖1和圖2。從圖1可以看出，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度在0～30 mg/L時(shí)，無機(jī)磷濃度與測(cè)定峰值之間形成很好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)可以達(dá)到0.9999，擬合方程為：y= 59188.13x- 30762.91(r2=0.9999)，其中y為標(biāo)準(zhǔn)系列峰高度，x為標(biāo)準(zhǔn)系列磷濃度(mg/L)。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

圖2 標(biāo)準(zhǔn)溶液峰形圖

從峰形圖可以看出，標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線峰形平滑，沒有雜峰，這說明反應(yīng)時(shí)間和其他反應(yīng)條件均在比較適宜的范圍內(nèi)，符合試驗(yàn)穩(wěn)定性要求。

2.2 精密度檢測(cè)

用質(zhì)量濃度分別為1 mg/L，6 mg/L，15 mg/L的3個(gè)代表低、中和高質(zhì)量濃度的樣品各測(cè)定10次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(表1)。精密度RSD在0.86%～3%之間。

表1 精密度測(cè)定結(jié)果

2.3 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

配置濃度為15 mg/L的磷標(biāo)準(zhǔn)溶液，取5 ml樣品溶液分別加入1mL不同濃度的磷標(biāo)準(zhǔn)溶液，定容到10mL后混勻，使用連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定其濃度，根據(jù)濃度計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果見表2。從表2可以看出，測(cè)得加標(biāo)回收率在96.8%～108.5%之間，平均加標(biāo)回收率為102.6%，說明該方法符合實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度要求。

表2 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 已知磷相關(guān)材料磷測(cè)定分析

分別對(duì)正常營(yíng)養(yǎng)液(200 μM磷)和低磷營(yíng)養(yǎng)液(10 μM磷)處理14天的水稻葉片和根的無機(jī)磷含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見圖3。從結(jié)果可以看出，無論是正常還是低磷處理的葉片，使用連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定無機(jī)磷，都能得到好的結(jié)果。

圖3 正常和低磷條件下無機(jī)磷測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，pho2、PHR2(O)、spx1、spx2、spx4等水稻材料無機(jī)磷含量高于野生型，phf1水稻材料無機(jī)磷含量低于野生型。使用連續(xù)流動(dòng)分析儀對(duì)上述磷相關(guān)材料葉片進(jìn)行無機(jī)磷測(cè)定分析，結(jié)果見圖4。

圖4 不同磷相關(guān)材料葉片無機(jī)磷測(cè)定

根據(jù)流動(dòng)分析儀測(cè)定結(jié)果(圖4)，無機(jī)磷含量高的磷相關(guān)突變體pho2、PHR2(O)、spx4等材料無機(jī)磷含量都顯著高于野生型，其中pho2材料磷含量最高，PHR2(O)次之，spx4材料磷含量比PHR2(O)要低；磷含量低的突變體phf1材料無機(jī)磷含量比野生型低，測(cè)定結(jié)果及趨勢(shì)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[1-3]。上述結(jié)果表明，連續(xù)流動(dòng)分析儀可以用來進(jìn)行磷相關(guān)材料的無機(jī)磷測(cè)定。

3 討論

SAN++型連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定無機(jī)磷濃度，使用的是鉬銻抗法，該方法顯色快，顏色穩(wěn)定，靈敏度較高，對(duì)干擾離子的允許量較大，從標(biāo)準(zhǔn)曲線、準(zhǔn)確度分析和加標(biāo)回收結(jié)果來看，該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線峰形平滑，回歸線性好，精密度在0.86%～3%之間，能夠滿足實(shí)驗(yàn)需要。而且雖然鉬銻抗法測(cè)定磷濃度沒有孔雀綠法靈敏度高，但是水稻葉片和根部的無機(jī)磷含量并不低，使用孔雀綠法時(shí)，反而會(huì)因?yàn)殪`敏度太高而需要高倍稀釋，造成不便。流動(dòng)分析儀使用自動(dòng)進(jìn)樣裝置，在連續(xù)、大批量無機(jī)磷測(cè)定時(shí)省時(shí)、省力，而且避免了人工操作帶來的誤差，在目前基因組學(xué)、表型組學(xué)研究中大有用途。

連續(xù)流動(dòng)分析儀在使用過程中，需要不定期進(jìn)行維護(hù)、清洗，否則會(huì)出現(xiàn)問題。首先儀器進(jìn)樣管道要定期使用次氯酸鈉清洗，而且要根據(jù)使用頻率不定期更換，否則會(huì)影響測(cè)定準(zhǔn)確度，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致峰形變差，甚至?xí)霈F(xiàn)不起峰現(xiàn)象；其次反應(yīng)試劑配置要準(zhǔn)確。由于反應(yīng)試劑中需要使用濃硫酸，為了安全起見，反應(yīng)I、C2可以一次性大量配置，多次分裝使用，避免多次接觸濃硫酸，反應(yīng)液G、E由于是反應(yīng)底物和催化劑，對(duì)結(jié)果影響大，需要仔細(xì)配置，而且因?yàn)樵噭┓€(wěn)定性原因，每次少量配置，低溫保存，最多放置2周。

4 結(jié)論

San++連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定水稻無機(jī)磷操作簡(jiǎn)單、分析速度快、準(zhǔn)確度高，尤其是大量測(cè)定時(shí)更加具有不可替代的優(yōu)勢(shì)，在水稻磷營(yíng)養(yǎng)相關(guān)研究中應(yīng)用前景廣闊。

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