程娜 蔡針華 呂加平 賈震虎 逄曉陽

（1. 山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，臨汾 041000；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193）

保加利亞乳桿菌是一種重要的乳品工業(yè)發(fā)酵用菌株，是發(fā)酵過程中產(chǎn)酸、產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)的主要菌株。保加利亞乳桿菌在發(fā)酵過程中易受噬菌體污染導(dǎo)致發(fā)酵失敗，這一直是困擾乳品工業(yè)的難題。所以研究乳酸菌抵御噬菌體攻擊的機制，并篩選抗噬菌體侵染的菌株是發(fā)酵乳產(chǎn)業(yè)亟待解決的關(guān)鍵問題［1］。噬菌體是專以細(xì)菌作為宿主的一種生物體，通常生活在一些細(xì)菌高密度聚集的地方，乳制品發(fā)酵過程易受噬菌體侵染也正是因為給噬菌體提供了數(shù)量龐大的菌體宿主［2］。相應(yīng)地，細(xì)菌與噬菌體在長期的斗爭中也進(jìn)化出了多種抵御噬菌體侵染的方式。如細(xì)菌可以通過在菌體表面生成胞外多糖類的生物膜［3］，利用物理阻隔的方式阻止噬菌體進(jìn)入菌體［4］；也可以通過菌體表面的噬菌體受體基因沉默［5］，進(jìn)而改變細(xì)菌表面受體來抵抗噬菌體的感染等等。但這些防御系統(tǒng)都無法給細(xì)菌提供特異性免疫，而CRISPR（Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats）以及Cas（CRISPR-associated）蛋白構(gòu)建的防御系統(tǒng)能夠給宿主菌提供特異性免疫以抵抗噬菌體或質(zhì)粒等外源基因的入侵［6］，限制基因的水平轉(zhuǎn)移［7］，并且具有精準(zhǔn)、高效、可遺傳的優(yōu)勢，近年來受到廣泛關(guān)注。

CRISPR-Cas系統(tǒng)存在于多數(shù)細(xì)菌和古細(xì)菌中，其作為后天獲得性免疫系統(tǒng)能夠抵抗噬菌體、質(zhì)粒等外源DNA的侵染，并且能夠通過不同的噬菌體感染而獲得相應(yīng)噬菌體的抗性［8］。CRISPR-Cas系統(tǒng)由重復(fù)序列（Direct Repeats，DR）、間隔序列（Spacer）、前導(dǎo)序列（Leading sequence）及Cas蛋白共同組成［9］。其中重復(fù)序列高度保守，具有回文序列，可以轉(zhuǎn)錄且形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)［10］。間隔序列與噬菌體、質(zhì)粒有著同源性，記錄著該菌株在長期進(jìn)化過程中曾經(jīng)遭受過哪些外源基因的侵入［11-13］。細(xì)菌在感染噬菌體后，噬菌體中的一段序列（Protospacer）被菌體CRISPR/cas系統(tǒng)所識別并被捕獲整合到細(xì)菌基因組的CRISPR區(qū)，形成一個間隔序列，正是間隔序列給宿主提供了識別外源噬菌體的能力。研究證實，若刪除間隔序列后，菌株抵抗噬菌體的能力隨之消失［14］。前導(dǎo)序列與重復(fù)序列相連，能夠識別新的間隔序列［15，16］，并啟動 crRNA（CRISPR RNAs）的轉(zhuǎn)錄［17］。CRISPR-Cas系統(tǒng)是針對噬菌體等外源基因的獲得性免疫系統(tǒng)［18］，并能將這種獲得性免疫系統(tǒng)穩(wěn)定遺傳給后代［8，16，19，20］

目前在乳酸菌上關(guān)于CRISPR-Cas系統(tǒng)防御噬菌體的系統(tǒng)研究只見于嗜熱鏈球菌，在2015年，李婉、霍貴成等［21］已對嗜熱鏈球菌基因組上的CRISPR的組成及抗噬菌體能力和作用機制進(jìn)行了初步的研究和預(yù)測，而另外一株重要的發(fā)酵菌株—保加利亞乳桿菌CRISPR的相關(guān)研究目前較少。因此本文對保加利亞乳桿菌的CRISPR序列進(jìn)行了系統(tǒng)分析，利用生物信息學(xué)方法對CRISPR區(qū)的DR序列進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析并預(yù)測了其二級結(jié)構(gòu)，同時對間隔序列也進(jìn)行了同源性分析，為探明保加利亞乳桿菌抗噬菌體的分子機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株及培養(yǎng)基 保加利亞乳桿菌LJJ-6來源于實驗室（已在中國普通微生物菌種保藏管理中心進(jìn)行專利保藏，保藏號CGMCC No.11346）、保加利亞乳桿菌ATCC11842來源于中國普通微生物菌種保藏管理中心（菌株編號CGMCC No.1.6970）；其他6株分離自市售酸奶，培養(yǎng)基采用MRS肉湯培養(yǎng)基。

1.1.2 試劑與儀器 細(xì)菌基因組提取試劑盒，北京天根生物技術(shù)有限公司；溶菌酶，Solabiro公司；TIANGEN 2×PCRMasterMix，天根生化科技有限公司；引物，華大基因科技有限公司；MRS肉湯，北京陸橋生物技術(shù)有限公司。LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；Sigma-3K15離心機，德國SIGMA科技有限公司；DYY-6C電泳儀，北京六一儀器廠；Fluor ChemFC2凝膠成像系統(tǒng)，美國Alpha公司；TP600-PCR擴(kuò)增儀，TakARA Bio INC；DHP-90278型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；WD-9403C 紫外儀，北京市六一儀器廠；HDL超凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培養(yǎng)及基因組DNA的提取 將冷凍保存的實驗菌株與從酸奶中分離得到的保加利亞乳桿菌轉(zhuǎn)接到MRS肉湯培養(yǎng)基中，37℃活化培養(yǎng)兩代，每代培養(yǎng)18 h。菌株總DNA的提取按照細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.2 CRISPR序列擴(kuò)增與測序 在NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上查找已公布全基因組序列的9株保加利亞乳桿菌基因組信息作為引物設(shè)計的模板，在9株保加利亞乳桿菌中每一株菌含一個或兩個CRISPR系統(tǒng)，僅少部分含2個CRISPR系統(tǒng)。根據(jù)其CRISPR上下游序列的保守性利用Primer Premier 7.0設(shè)計了5種不同類型的CRISPR區(qū)擴(kuò)增引物，確保了 CRISPR位點擴(kuò)增時不被遺漏。然后對8株實驗菌株分別用這5種不同引物進(jìn)行CRISPR一一擴(kuò)增，將有擴(kuò)增結(jié)果的條帶進(jìn)行測序驗證。按試劑盒說明書建立PCR反應(yīng)體系（50 μL）：DNA 模板 2 μL；正向引物 1 μL；反向引物 1 μL ；10×LongTaqBufferⅠ 5 μL ；dNTP Mixture（2.5mmol·L-1）4 μL ；ddH2O 37 μL。

PCR反應(yīng)循環(huán)設(shè)置：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 sec，60℃退火30 sec，72℃延伸3 min，72℃終延伸5 min，37 cycles。結(jié)果檢測：待反應(yīng)結(jié)束后，取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 μL，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將目的條帶單一的樣本送公司測序。

1.2.3 CRISPR基因座活性分析 對擴(kuò)增的8株實驗菌的CRISPR與NCBI中已公布全基因組序列的9株德氏乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌的CRISPR序列利用CRISPR Finder（http://crispr.u-psud.fr/Server/）在線軟件進(jìn)行查找，統(tǒng)計標(biāo)準(zhǔn)菌株及實驗菌株中每個CRISPR所含的獨特間隔序列的數(shù)目，分析基因座活性。利用GraphPad Prism 7軟件制作圖。

1.2.4 CRISPR序列同源性分析 對實驗菌株保加利亞乳酸桿菌、標(biāo)準(zhǔn)菌株保加利亞乳酸桿的CRISPR區(qū)進(jìn)行重復(fù)序列整理。將重復(fù)序列利用MEGA7軟件下的鄰接法（Neighbor-JoiningMethod），自展值（Bootstrap value）分析重復(fù)次數(shù)為1 000次構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對重復(fù)序列進(jìn)行同源性分析。

1.2.5 重復(fù)序列二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 將測序得到的重復(fù)序列轉(zhuǎn)換成RNA序列后，在線提交RNAfoldWebServer（http://rna.tbi.univie.ac.at/cgibin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi）服務(wù)器，進(jìn)行重復(fù)序列二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析。

2 結(jié)果

2.1 CRISPR序列擴(kuò)增與測序

根據(jù)NCBI 中已公布全基因組序列的德氏乳桿菌保加利亞乳酸桿菌為標(biāo)準(zhǔn)菌株設(shè)計引物，CRISPR區(qū)序列的擴(kuò)增引物如表1。用每一類型的CRISPR引物分別對8株實驗菌進(jìn)行一一擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果見圖1。在8株實驗菌均含有一個可信CRISPR區(qū)，ATCC11842、GM在以CRISPR1為擴(kuò)增引物的條件下，在大于2 000 bp附近均有清晰條帶出現(xiàn)，而在其他引物擴(kuò)增中均未獲得擴(kuò)增條帶；LJJ-6在CRISPR2為擴(kuò)增引物的條件下，在2 000 bp處有清晰單一條帶，其他擴(kuò)增引物均未擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶；SY、YL在CRISPR4為擴(kuò)增引物的條件下，在1 000-2 000 bp之間均有清晰條帶，且擴(kuò)增效率高、特異性較強，其他引物擴(kuò)增下均沒有發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增結(jié)果；MN、JLB在CRISPR2引物擴(kuò)增下，在800 bp附近均擴(kuò)增出單一條帶，且無非特異性條帶出現(xiàn)，其他引物均未獲得擴(kuò)增條帶；WD在CRISPR5為引物下出現(xiàn)了擴(kuò)增結(jié)果，大約在 500 bp附近，其余引物擴(kuò)增下均無擴(kuò)增結(jié)果。將擴(kuò)增的單一條帶送公司測序。

表1 CRISPR序列的擴(kuò)增引物

圖1 CRISPR序列擴(kuò)增

2.2 CRISPR序列的檢測

對測序結(jié)果分析整理，用CRISPR-Finder進(jìn)行CRISPR序列查找鑒定，可知圖1中擴(kuò)增條帶均為CRISPR序列。CRISPR序列信息如表2，其中CRISPR序列最長為1 820 bp，含有30個間隔序列，最短僅408 bp，含5個間隔序列。重復(fù)序列最長為36 bp，最短為28 bp。

表2 8株保加利亞乳桿菌CRISPR概況

2.3 CRISPR基因座活性分析

9株保加利亞乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株及8株實驗菌株，共17株菌各個CRISPR基因座所含的獨特間隔序列數(shù)目散布圖如圖2。其中CRISPR1基因座出現(xiàn)了5次，在基因組中出現(xiàn)頻率較高，其間隔序列最多21個，平均約17個；CRISPR2基因座中間隔序列數(shù)目變化較大，最多為63個，最少只有5個，平均約33個；CRISPR3、CRISPR5在基因組中出現(xiàn)的頻率較低，其基因座間隔序列數(shù)最多為11個，最少僅8個；CRISPR4基因座中的間隔序列數(shù)目最多為39個，最少15個，平均為25個。CRISPR6基因座中間隔序列最多為30個，最少18個，分布均勻每個基因座平均約23個間隔序列。

圖2 CRISPR重復(fù)-間隔序列的數(shù)目分布

由圖2可以看出，CRISPR2基因座中間隔序列數(shù)目的最大值和平均值均為最高，因此推測出保加利亞乳桿菌中CRISPR2基因座最為活躍，則對抗外來基因元件入侵的能力更強，CRISPR4基因座次之。而CRISPR3、CRISPR5基因座中間隔序列數(shù)目最低且在基因組中出現(xiàn)的頻率最低，因此推測保加利亞乳桿菌中CRISPR3、CRISPR5基因座最不活躍。

2.4 CRISPR序列同源性分析

將8株實驗菌株的重復(fù)序列與NCBI 中已公開全基因組序列的9株標(biāo)準(zhǔn)菌株保加利亞乳桿菌CRISPR重復(fù)序列歸納整理構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹（圖3）。該進(jìn)化樹主要包含8個分支，WD菌株的DR與ND02、JCM1738標(biāo)準(zhǔn)菌株的DR位于同一分支；實驗菌株MN、YL與標(biāo)準(zhǔn)菌株2038、DSM20080、KCTC1373的DR位于同一分支，且同源性較高；JLB、SY的DR與標(biāo)準(zhǔn)菌株ND04的DR位于同一分支上，LJJ-6與GM、ATCC11842的DR位于同一分支，同源性高度一致，在進(jìn)化方向上相近。

2.5 DR序列的二級結(jié)構(gòu)分析

通過對17株保加利亞乳桿菌CRISPR區(qū)的6種重復(fù)序列RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測時均發(fā)現(xiàn)，重復(fù)序列均可形成如圖4的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，根據(jù)莖環(huán)的數(shù)量特征可以分為兩類，一類是如圖4（a）、（b）、（c）僅有1個莖區(qū)，2個大小不同的環(huán)部分配莖區(qū)兩側(cè)，以“環(huán)”為主。另一類是如圖4（d）、（e）、（f）形成多個莖、環(huán)，以“莖”為主，同時在序列比對分析還發(fā)現(xiàn)一個重復(fù)序列對應(yīng)多種不同的間隔序列，而一個間隔序列只對應(yīng)一個重復(fù)序列，二級結(jié)構(gòu)的形成可能與新Spacer及cas編碼蛋白的相互作用有關(guān)。據(jù)文獻(xiàn)報道，新Spacer通常會插入CRISPR區(qū)前導(dǎo)序列與第1個 DR 之間［16，17］。

3 討論

圖3 重復(fù)序列的遺傳進(jìn)化分析

圖4 重復(fù)序列二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

細(xì)菌CRISPR作為一種抵御噬菌體攻擊的獲得性防御機制，近年來已經(jīng)成為研究領(lǐng)域的熱點。在乳制品發(fā)酵行業(yè)中，CRISPR作為一種高效的抗噬菌體系統(tǒng)，已在嗜熱鏈球菌中被證明［22］。對于每個獨特的間隔序列都是從入侵的外源基因元件中捕獲的，然后整合到自己的基因組中，形成一個獲得性免疫記憶系統(tǒng)，產(chǎn)生特異性的記憶功能，在下次有攜帶相同序列或外源片段入侵時，它們會迅速識別，并募集體內(nèi)的相關(guān)cas蛋白（比如cas9）對目標(biāo)基因進(jìn)行切割，產(chǎn)生相對應(yīng)的抗性，來抵抗外源基因的入侵。所以通過基因改造CRISPR結(jié)構(gòu)將已知侵染發(fā)酵的噬菌體保守序列插入發(fā)酵菌的CRISPR結(jié)構(gòu)中，使之形成特異性的記憶免疫系統(tǒng)［23］，在噬菌體侵染時會產(chǎn)生相應(yīng)的抗性以抵御這些噬菌體的侵染，這對于開發(fā)抗噬菌體的發(fā)酵菌株具有較好的應(yīng)用前景。本研究中8株保加利亞乳桿菌CRISPR的126個DR序列與126個spacer序列，分別來自8個不同廠家的商品化酸奶，由于發(fā)酵菌株的不同，且在長期進(jìn)化過程中遇到的外源攻擊元件也不同，因此造成菌株CRISPR序列的顯著差異。將17個CRISPR結(jié)構(gòu)進(jìn)行歸納整理為6種不同類型的CRISPR系統(tǒng)，對每一類型的CRISPR基因座活性進(jìn)行了預(yù)測分析，結(jié)果顯示spacer序列豐富的其基因座活性高，可能的原因是CRISPR位點越豐富所產(chǎn)生的特異性識別就會越強，由于細(xì)菌CRISPR間隔序列來源于外源核酸片段，而核酸片段通常是指病毒噬菌體、質(zhì)粒DNA。所以來源于噬菌體的外源片段越豐富，產(chǎn)生相應(yīng)抗性的種類就越多，意味著細(xì)菌抗噬菌體能力越強。因此CRISPR基因座中間隔序列的數(shù)目和種類可在一定程度上反映該CRISPR基因座的活性程度［24］。CRISPR系統(tǒng)存在leader序列，repeat序列，spacer片段，cas基因，而leader序列與緊鄰的末端repeat序列之間存在新spacer插入位點，推測可能為相關(guān)cas蛋白的結(jié)合位點［16］。本文研究了9株保加利亞乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株及8株實驗菌株的17個CRISPR系統(tǒng)均發(fā)現(xiàn)較為保守的回文結(jié)構(gòu)，該回文結(jié)構(gòu)極可能為相關(guān)cas蛋白結(jié)合位點。在對8個實驗菌株的CRISPR結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn)，除了repeat數(shù)目較多的CRISPR結(jié)構(gòu)有30個之外，有的僅有5個repeat序列的CRISPR結(jié)構(gòu)。

據(jù)文獻(xiàn)報道，獨特的間隔序列是宿主防御入侵的噬菌體或質(zhì)粒DNA形成的一種特異性免疫識別系統(tǒng)［23］。在對實驗菌株間隔序列進(jìn)行比對分析時發(fā)現(xiàn)，96條間隔（除已公布序列的ATCC11842菌株的30條）序列中僅15條完全比對上原間隔序列，比對率較低，與Mojica等［25］的研究報道，對4 500條spacer進(jìn)行blast比對分析發(fā)現(xiàn)僅88條與原間隔序列且有較高的相似性。相關(guān)的原因據(jù)Edwards等［26］報道為：第一，spacer序列較短且異常多樣化，能夠比對到顯著相似性外源片段的概率較低；第二，可能是由于對應(yīng)的噬菌體數(shù)據(jù)庫目前還不夠完善，已知噬菌體的序列較少，還不能從現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中檢索到spacer序列相似的外源片段。此外還有49條間隔序列與自然界的質(zhì)粒與噬菌體有著高相似性，且比對到來源于噬菌體的大于質(zhì)粒的，說明很有可能CRISPR結(jié)構(gòu)間有著基因水平轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象存在，乳酸菌抗噬菌體能力的強弱可能與CRISPR結(jié)構(gòu)存在一定的聯(lián)系，此外分析時還發(fā)現(xiàn)同一個重復(fù)序列對應(yīng)著多個不同間隔序列，而一個間隔序列只對應(yīng)一個重復(fù)序列，推測可能的原因是重復(fù)序列是一種識別機制，這還有待進(jìn)一步研究的證明。這一點與焦雪等［27］的報道相似。同時對于同源性較高的菌株它們的間隔序列和重復(fù)序列也會存在很大的不一致性，這可能是由于它們的生長環(huán)境不一致造成的差異性。本研究還發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌屬的其他菌株Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus2038、KCTC13731、DSM20080與實驗菌株Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricusMN、YL的重復(fù)序列相同，但它們的親緣關(guān)系是相對較遠(yuǎn)的，可能的原因是發(fā)生了水平基因轉(zhuǎn)移CRISPR序列，這種情況在其他菌株中也有發(fā)現(xiàn)［28］?？傊?，本研究為探明保加利亞乳桿菌抗噬菌體的分子機制奠定基礎(chǔ)，也為篩選、開發(fā)和改造抗噬菌體的發(fā)酵劑菌株提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，具有較高的實際意義和應(yīng)用價值。

4 結(jié)論

本文以9株已公布全基因組序列的保加利亞乳桿菌和8株實驗株為基礎(chǔ)，對保加利亞乳桿菌的CRISPR進(jìn)行了系統(tǒng)的生物信息分析，并對菌株的抗噬菌體侵染能力進(jìn)行了預(yù)測和分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CRISPR中間隔序列的高度可變性的特點。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)CRISPR2基因座的活性最高，抗噬菌體能力較強。同時發(fā)現(xiàn)在ATCC11842同一株菌的2個不同CRISPR結(jié)構(gòu)也是存在一定的差異，說明CRISPR結(jié)構(gòu)的多態(tài)性變化。

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