史金虎，王 剛，郭留雄，李守賓，孫福振，楊 濤，姜崇浩，周天寶，羅慶先，劉俊江

(1.河北省人民醫(yī)院泌尿外科，河北石家莊 050002;2.河北北方學院研究生院，河北張家口 075002)

膀胱腫瘤是臨床上常見的泌尿外科疾病[1]，在美國其發(fā)病率位居男性腫瘤第2位，僅次于前列腺癌，在我國居第一位且大部分屬于表淺性膀胱腫瘤，占60%[2]。目前全世界范圍內(nèi)每年新發(fā)膀胱癌患者病例超過30余萬例，位列人體常見腫瘤發(fā)病率的第7位，腫瘤死亡率排在第8位，嚴重威脅著人類的健康與生命安全[3]。近年來腫瘤標記物診斷因其敏感性較高，在臨床中應(yīng)用越來越廣泛，其中腫瘤標記物主要關(guān)注的焦點在MIRNA上。

目前世界上多個研究中心的研究結(jié)果表明，MIRNA可以作為潛在的腫瘤標記物，MIRNA是一種非編碼類RNA，由內(nèi)源性的大小19～23個堿基的單鏈非編碼的小分子RNA，其主要通過與mRNA 互補結(jié)合并參與基因調(diào)控表達，調(diào)節(jié)其翻譯和穩(wěn)定性，發(fā)揮著轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的作用[4]。MIRNA可以調(diào)節(jié)許多蛋白的編碼的基因，抑制蛋白的合成或者促進蛋白的合成，調(diào)節(jié)細胞的分化、發(fā)育、凋亡等轉(zhuǎn)錄過程中的基因表達水平，這表明了它既可以誘導癌基因的表達促進腫瘤形成，同時又可以抑制癌基因的表達，減緩腫瘤的形成或避免腫瘤形成，這些方面都表明MIRNA與腫瘤有一定的關(guān)系[5-6]。

本研究旨在通過檢測膀胱癌患者和健康受試者血清樣本中的MIR-92a、MIR-100及MIR-143的相對表達水平，分析其表達水平以及探討其對膀胱癌的診斷價值。

1 資料與方法

1.1一般資料本研究通過收集河北省人民醫(yī)院2016年10月至2017年4月期間，50例臨床及病理診斷為膀胱癌的患者為觀察者，其中男35例，女15例，平均年齡(54.8±5.46)歲，所有的膀胱癌患者根據(jù)活檢或術(shù)后病理類型分為非浸潤性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer，NMIBC)組[平均年齡(56.3±10.8)歲]和浸潤性膀胱癌(muscle invasive bladder cancer，MIBC)組[平均年齡(53.7±6.6)歲]。對照組為50例同期體檢正常的健康人群，其中男38例，女12例，平均年齡(55.6±8.9)歲。觀察者納入標準：①臨床資料完善；②存在病理診斷。排除標準：①長期慢性或復(fù)發(fā)性泌尿系感染者或血尿者；②肝腎功能嚴重不全者；③存在其他部位的實性腫瘤或惡性血液性疾??；④接受過放射線、化學治療、生物靶向治療、中藥治療者。對照組排除標準：①急性泌尿系感染者或尿出血者；②存在家族性遺傳性惡性腫瘤者；③近期應(yīng)用過免疫抑制劑或大量激素者。對照組與觀察組的一般臨床資料(性別比例、平均年齡)差異無統(tǒng)計學意義。本研究的病理分期采用2002年國際抗癌聯(lián)盟(Union for International Cancer Control，UICC)發(fā)表的第6版TNM分期[7]法進行分期，組織學分級采用2004年WHO發(fā)表的分級法進行分級。河北省人民醫(yī)院倫理委員會審議通過了本次研究過程。所有的受試者入組之前均向患者及其家屬詳細交代了試驗?zāi)康?，并簽署知情同意書?/p>

1.2試劑與儀器血清總RNA提取試劑盒，MIRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和MIRNA SYBR Green PCR試劑盒均購自TaKaRa 公司；PCR儀器(聚合酶鏈反應(yīng)儀器)(型號9700)及實時熒光定量PCR儀(StepOne TM)均購自美國ABI公司，Trizol試劑購自上?；鄯f生物科技有限公司，MIR-92a、MIR-100及MIR-143特異性反轉(zhuǎn)錄引物與實時定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-qPCR)特異性擴增引物購自南通百奧邁科公司。微量紫外可見分光光度計(K5600)購自北京凱奧科技發(fā)展有限公司。

1.3標本的采集及制備從膀胱癌患者或健康受試人群的肘正中靜脈抽取10 mL血，存放入含有乙二胺四乙酸二鈉的試管中，隨后將其置于離心機中，離心3 000 r/min，4 ℃，離心10 min，然后再置入離心機中，5 000 r/min，4 ℃，離心5 min。離心結(jié)束后，將離心管常規(guī)噴灑酒精消毒后置于安全柜內(nèi)，去除上清，加入1 mL含10%FBS的培養(yǎng)基并吹打混勻形成細胞懸液，將細胞懸液吸入凍存管，再加入 350 μL上述培養(yǎng)基，4 ℃預(yù)冷15 min；其后加入150 μL DMSO，輕輕吹打混合均勻，標記細胞種類及凍存日期，封口膜封口，放入凍存盒內(nèi)置于-80 ℃冰箱過夜，次日再移入液氮罐內(nèi)保存?zhèn)溆?。我們只選用非溶解性紅細胞的血液樣本，因為溶解性的紅細胞容易影響MIRNA的水平。溶解性的紅細胞通過541 nm的光譜探測檢出。

1.4提取檢測MIRNA取出提取的細胞(擰緊)，立即放入37.0 ℃的水浴箱中，90 s從中取200 μL樣本，利用血清總RNA提取試劑盒提取總RNA，并用提取的MIRNA取5 μL利用MIRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)的條件為：16 ℃ 30 min、42 ℃ 30 min、85 ℃ 5 min。當MIRNA反轉(zhuǎn)錄完成后，取5 μL利用RT-qPCR將其進行擴增。取25 μL樣本液應(yīng)用SYBR Green PCR試劑盒將放入周圍溫度為95 ℃的環(huán)境中15 min，接著放入94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 34 s進行40個循環(huán)，然后在70 ℃環(huán)境中進行MIRNA 實時定量 PCR 檢測。以U6作為內(nèi)參，根據(jù)系統(tǒng)生成的樣本拷貝數(shù)，采用定量PCR中的相對定量法檢測MIR-92a、MIR-100及MIR-143的表達水平。MIRNA的表達水平用△循環(huán)閾值(△Ct)表示，△Ct=Ct(MIR-92a、MIR-100及MIR-143)-Ct(U6)。上述所有操作均按照試劑盒說明書進行操作，并且重復(fù)操作3次，取其平均值。MIR-92a、MIR-100及MIR-143的相對表達水平用2-△Ct計算法計算。

2 結(jié) 果

2.1MIRNA的相對表達水平如表1所示，膀胱癌患者的血清中MIR-92a、MIR-100及MIR-143的相對表達水平相對于健康人群組(50人)明顯降低，而且MIR-143的相對表達水平在MINC(35人)與NMIBC(15人)中有顯著的不同，各組數(shù)據(jù)均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1各組MIRNA的相對表達水平比較

組別例數(shù)MIR-92aMIR-100MIR-143NMIBC150.537±0.2100.340±0.154 0.592±0.094MIBC350.522±0.1790.294±0.248 0.293±0.171健康人群500.956±0.2680.795±0.364 0.671±0.090 2F值12.34128.8065.916P值0.0010.0000.017

2.2血清中MIR-92a、MIR-100及MIR-143的相對表達水平對膀胱癌的診斷價值本研究通過分別分析單個檢測MIRNA的表達以及兩者組合及三者組合聯(lián)合檢測分析MIRNA的表達對膀胱癌的診斷價值。MIR-92a、MIR-100及MIR-143的臨界值分別為0.590、0.654、0.380。曲面下面積及靈敏度、特異度如圖1所示：

A：MIR-92a；B：MIR-100;C：MIR-143;D：MIR-92a，MIR-100;E:MIR-92a，MIR-143;F：MIR-100，MIR-143;G:MIR-92a，MIR-100及MIR-143。

圖1血清中MIR-92a、MIR-100及MIR-143的ROC曲線及靈敏度、特異度

3 討 論

膀胱腫瘤是泌尿系統(tǒng)中最為常見的惡性腫瘤之一，治療后復(fù)發(fā)率較高,因此早期發(fā)現(xiàn)、早期治療就顯得尤為重要。MIRNA不僅可作為一種潛在的腫瘤診斷標記物，而且對其預(yù)后的評判也可以作為參考物。目前已有多種膀胱癌腫瘤標記物被報道可用于膀胱癌診斷或監(jiān)測，但尚無實際臨床應(yīng)用[8]。有研究報道指出，人類大約有50%的癌癥與MIRNA有關(guān)[9]。2007年全球第1例報道膀胱癌中MIRNA表達改變的文章在Urol Oncol[10]上被發(fā)表，此后，關(guān)于MIRNA在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的作用成為研究熱點。夏偉、宋濤等[11]利用MIRNA芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)了在膀胱癌組織中145種MIRNA有統(tǒng)計學意義的差異變化，其中下調(diào)的有42種，包括MIR-143、MIR-145、MIR-99a等，上調(diào)的有73種，包括MIR-708、MIR-182等。WANG S等[12]、NOGUCHI等[13-15]及ADAM等[16]發(fā)現(xiàn)膀胱癌患者的MIR-100、MIR-143/145及MIR-92a顯著低表達。在我們的研究中，用樣本MIRNA的相對表達水平作為標記物去檢測膀胱癌患者。在實驗中我們選取了3種MIRNA(MIR-92a，MIR-100及MIR-143)已經(jīng)在國外雜志中發(fā)表并證實它們在膀胱癌組織細胞中的表達水平下降，可作為潛在標記物。本研究通過檢測血清樣本中3種MIRNA的相對表達水平來確定其是否可以作為腫瘤潛在標記物。

在本研究中，膀胱癌患者中3種MIRNAs的表達水平與健康人群比較明顯降低，而且血清中MIR-143的相對表達水平可以作為膀胱癌患者中區(qū)別MINC與NMIBC的初步診斷指標(P<0.05)。通過本實驗可以看出MIR-92a、MIR-100及MIR-143可以作為初步診斷膀胱癌的潛在標記物。

我們應(yīng)用ROC曲線分析了單獨的MIR-92a、MIR-100、MIR-143以及兩者或三者組合聯(lián)合檢測對膀胱癌的診斷價值。根據(jù)結(jié)果顯示兩者組合中MIR-92a與MIR-143組合的靈敏度及特異度最高，與三者組合相比MIR-92a與MIR-143組合無明顯差異，這提示我們MIR-92a與MIR-143組合在診斷膀胱癌中具有較好的診斷價值，可以作為血清檢測膀胱癌的潛在標記物。

但是本實驗還存在一定的缺陷:第一，樣本較小，未來可以通過大樣本進一步確認;第二，所有血清MIRNAs的樣本均為我國患者，其是否適用于全球其他地區(qū)還需進一步證實。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，膀胱癌患者血清中MIR-92a、MIR-100及MIR-143相對表達水平明顯降低，MIR-92a與MIR-143組合聯(lián)合檢測其表達水平可以更好地診斷膀胱癌。

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