楊總應(yīng)， 蔣向輝

(凱里學(xué)院化學(xué)與材料工程學(xué)院，貴州凱里 556011)

金銀花(Lonicerajaponica)別稱忍冬，2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定其為忍冬科忍冬屬忍冬干燥花蕾或帶初開的花[1]。金銀花原產(chǎn)于我國(guó)山東、河北、河南等省，近年來在湖南、貴州、四川等省均有引種栽培。金銀花性味甘寒，具有清熱解毒、去風(fēng)熱等功效，近年來研究發(fā)現(xiàn)，金銀花在降血脂、調(diào)節(jié)人體免疫與抗病毒方面有特殊的療效[2]。隨著以金銀花為主要原料的一系列藥用與保健產(chǎn)品的開發(fā)，金銀花的市場(chǎng)價(jià)值越來越重要。金銀花含有140多種化合物，揮發(fā)油類、綠原酸類、黃酮類、三萜類是其主要成分，其中黃酮類化合物有木犀草素-7-O-α-D-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-β-D-半乳糖苷、5-羥基-3′，4′，7-三甲氧基黃酮、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、金絲桃苷等[3-4]。

筆者所在實(shí)驗(yàn)室曾以金銀花為試驗(yàn)材料，采用差異表達(dá)的方法克隆得到LjFNS基因的中間序列(GenBank登錄號(hào)JQ716370.1)，測(cè)序后利用美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(national center for biotechnology information，簡(jiǎn)稱NCBI)的Blast分析軟件進(jìn)行序列相似性搜索，發(fā)現(xiàn)該序列與擬南芥基因組中的細(xì)胞色素P450基因的序列相似。為了進(jìn)一步研究該基因在金銀花生長(zhǎng)發(fā)育中的功能，本研究采用染色體步移方法，以金銀花為試驗(yàn)材料，克隆得到該基因的基因組序列和編碼序列(coding sequence，簡(jiǎn)稱CDS)，在對(duì)序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)的方法分析LjFNS在金銀花莖、葉與花等不同組織以及幼葉、老葉、白花與黃花等不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)特性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)中采用的金銀花采自懷化學(xué)院藥用植物園，金銀花植株于2012年引自河南省新鄉(xiāng)市，經(jīng)懷化學(xué)院劉光華教授鑒定為忍冬屬植物金銀花。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組序列的克隆 參照蔣向輝等關(guān)于植物葉片DNA提取的改良CTAB法[5]提取金銀花總DNA，用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。用4種不同的限制性內(nèi)切酶(AatⅡ、BamH Ⅰ、ClaⅠ、FseⅠ，購自美國(guó)NEB公司)酶切基因組DNA，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切結(jié)果。酶切產(chǎn)物采用DNA回收試劑盒進(jìn)行回收純化，在回收的DNA片段兩頭分別接上接頭AD1(5′-GATCCGAGTGGCTTACAGCGATAG CGGATGACGGGACAGGTAGCTAATA-3′)和AD2(3′-H2N-CGGCTTGT-PO4-5′)，構(gòu)建4種不同酶切產(chǎn)物的Genome Walker DNA文庫，分別命名為FNS-1、FNS-2、FNS-3和FNS-4。分別以4個(gè)不同的文庫DNA為模板，進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，第1輪PCR引物為接頭引物AP1(5′-CTGCCGAGTGGCTTAGGCCAGT-3′)與特異性引物GSP1(L1：5′-AGGTTGCCGTTAGTTCCGGATTTGATT-3′和R1：5′-TCGCCGTGACCGGATGGTCGAAGTAGCT-3′)，PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，67 ℃ 5 min，29個(gè)循環(huán)；67 ℃延伸5 min。用DNA回收試劑盒回收第1輪PCR產(chǎn)物，稀釋50倍后，以此為模板進(jìn)行第2輪PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為接頭引物AP2(5′-TTACGGCTGATGGC TTTGA-3′)與特異性引物GSP2(L2：5′-GTACGTGATT AGCCAGTAGGACGTGGA-3′和R2：5′-TTGCAGGGTCA GGTAAAGTGTGGTACG-3′)，PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 45 s，72 ℃ 3 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 45 s，65 ℃ 3 min，21個(gè)循環(huán)；65 ℃ 延伸5 min。同樣采用DNA提取試劑盒回收第2輪PCR產(chǎn)物，將回收片段連接至T載體后送上海伯豪生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序所得DNA序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行序列比對(duì)并拼接，以拼接DNA序列為參考，設(shè)計(jì)LjFNS基因全長(zhǎng)克隆引物L(fēng)jFNS-F(5′-ATGTCTTGGCTTTATCTTTTAGACA-3′)、LjFNS-R(5′-AATACGATAGAATGCGGAACTCG-3′)，進(jìn)一步以金銀花總DNA為模板擴(kuò)增LjFNS基因全長(zhǎng)序列。

1.2.2 編碼序列預(yù)測(cè)與克隆 利用NCBI中的Blast分析軟件，對(duì)克隆得到的LjFNS基因組序列進(jìn)行比對(duì)，對(duì)編碼序列進(jìn)行預(yù)測(cè)。以金銀花初開的花為材料，采用Invitrogen公司的TRIzol試劑盒提取金銀花總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，以cDNA為模板，用引物L(fēng)jFNSF(5′-ATGTCTTGGCTTTA TCTTTTAGACA3′)、LjFNSR(5′-UUAACGATAGAATGCG GAACTAG-3′)對(duì)LjFNS基因的CDS全長(zhǎng)進(jìn)行克隆。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 用DNAMAN軟件與GENEDOC軟件相結(jié)合進(jìn)行LjFNS基因DNA序列的組成分析以及與相似基因的同源性比對(duì)分析。采用Protparam在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)LjFNS基因編碼蛋白的氨基酸序列、分子量、等電點(diǎn)、穩(wěn)定性和親水性等理化性質(zhì)；采用SignalP在線軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)的信號(hào)肽分析；采用Wolfpsort在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行LjFNS基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)；采用TMHMM在線軟件進(jìn)行LjFNS基因編碼蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域與功能域的分析。

1.2.4 組織表達(dá)特異性分析 采用Invitrogen公司的TRIzol試劑盒分別提取金銀花幼葉、老葉、幼莖、綠蕾、白花和黃花的總RNA，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。檢測(cè)LjFNS基因表達(dá)的定量PCR引物為L(zhǎng)jFNS-Q-F(5′-CGTACTCAAACTCACCGAAAG-3′)和LjFNS-Q-R(5′-GCATTCAATTGCTGTTCTCCTGT-3′)。以苜蓿β-Actin基因?yàn)閮?nèi)參，定量PCR引物為Actin-F(5′-AGGGAGTCGTGAAAGGTTGTC-3′)和Actin-R(5′-TTCCTGGTCTCGTAGTAGAGTTCG-3′)。采用購自TaKaRa公司的SYBR Premix ExTaqTM試劑盒，將各組織的cDNA稀釋適當(dāng)倍數(shù)(通常為100 ng/μL以下)作為模板，使用Mx3000P(Stratagene)熒光定量PCR儀進(jìn)行qPCR反應(yīng)，反應(yīng)體系總體系為25 μL，其中SYBR Premix ExTaqTM(5×)5 μL，Rox Reference Dye Ⅱ(10×)2.5 μL，正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL，cDNA1 μL，ddH2O 16.5 μL，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，38個(gè)循環(huán)。qPCR檢測(cè)重復(fù)5次，采用Mx3000P軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 LjFNS基因全長(zhǎng)序列的克隆

采用上游特異引物GSP1與接頭引物AP1、下游特異引物GSP2與接頭引物AP2，分別以4個(gè)酶切產(chǎn)物DNA文庫為模板進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，用文庫FNS-1能擴(kuò)增出上游的清晰條帶，用文庫FNS-2能擴(kuò)增出下游的清晰條帶(圖1-a)?；厥占兓疨CR產(chǎn)物，利用特異引物GSP2和接頭引物AP2進(jìn)行測(cè)序。將克隆到的上游片段稱為FNS-F，下游片段稱為FNS-R，并將這2個(gè)DNA序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對(duì)分析，其中下游片段與金銀花LjFNS基因的中間序列(GenBank登錄號(hào)：JQ716370.1)有重疊，隨后將FNS-F、FNS-R與LjFNS基因的中間序列進(jìn)行序列拼接，并將拼接結(jié)果在NCBI中進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果顯示，此拼接序列與LOC9307309基因序列相似度達(dá)89%，推測(cè)此序列編碼的基因可能是與擬南芥LOC9307309同源的基因，將其命名為L(zhǎng)jFNS。

根據(jù)拼接序列設(shè)計(jì)得到LjFNS基因全長(zhǎng)引物L(fēng)jFNSF與LjFNSR，以金銀花基因組DNA為模板，克隆得到1個(gè)全長(zhǎng)為1 701 bp的序列(圖1-b)，其與拼接結(jié)果一致，證明克隆到的是金銀花LjFNS基因全長(zhǎng)序列。隨后以金銀花cDNA為模板，利用引物L(fēng)jFNSF與LjFNSR進(jìn)行擴(kuò)增。對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增到的目的片段含有1 593 bp完整開放閱讀框(ORF)，比其基因組序列少1段108 bp的內(nèi)含子序列。此外，氨基酸序列相似度達(dá)89%。隨后，利用GENEDOC多序列比對(duì)與分析軟件對(duì)LjFNS與LOC9307309的CDS序列和氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，由圖2可以看出，LjFNS與LOC9307309的編碼序列高度相似，推測(cè)LjFNS與LOC9307309是同源基因。

2.2 LjFNS基因生物信息學(xué)分析

利用NCBI中的Blast分析軟件，對(duì)克隆得到的LjFNS基因組序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，該基因組全長(zhǎng)為1 701 bp，有2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子，編碼序列長(zhǎng)1 593 bp，編碼530個(gè)氨基酸。LjFNS編碼蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)顯示，其蛋白序列長(zhǎng)度為530個(gè)氨基酸，分子式為C2 676H4 223N737O735S25，含纈氨酸(Val)最多，占比達(dá)12.1%，不含吡咯賴氨酸(Pyl)、酪氨酸(Tyr)(表1)，等電點(diǎn)(pI)為9.03，分子量為58.036 8 ku，其不穩(wěn)定性系數(shù)為37.11(<50.00)，通常歸于穩(wěn)定性蛋白一類，氨基酸殘基側(cè)鏈帶完全正電荷的賴氨酸、精氨酸與組氨酸總和為69個(gè)，氨基酸殘基側(cè)鏈帶完全負(fù)電的谷氨酸與天冬氨酸總和為54個(gè)，蛋白帶正電荷，為堿性蛋白質(zhì)。脂肪族氨基酸指數(shù)為57.49，芳香族氨基酸與雜環(huán)族氨基酸指數(shù)的總和為87.49，多環(huán)類氨基酸較多，這可能與其催化黃酮類物質(zhì)的合成功能有關(guān)。LjFNS蛋白親水性系數(shù)為 -0.062，該蛋白歸于疏水性蛋白一類。用SignalP在線軟件對(duì)LjFNS蛋白的信號(hào)肽分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白中膜錨定信號(hào)較強(qiáng)，該蛋白屬于膜蛋白。采用Wolfpsort在線軟件對(duì)LjFNS蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析結(jié)果顯示，該蛋白定位于葉綠體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和液泡膜。采用TMHMM在線分析發(fā)現(xiàn)，LjFNS蛋白具有跨膜結(jié)構(gòu)域，其跨膜區(qū)域定位于第112～138位氨基酸區(qū)域，而第17～32位氨基酸定位于膜內(nèi)區(qū)域，其余氨基酸定位于膜外區(qū)域。用 SMART軟件對(duì)LjFNS蛋白的功能域進(jìn)行分析， 結(jié)果顯示， 該蛋白含有亞鐵血紅素配合基結(jié)合位點(diǎn)，這是細(xì)胞色素P450家族的保守性區(qū)域，推測(cè)LjFNS蛋白屬于細(xì)胞色素P450家族。

表1 LjFNS蛋白的氨基酸組成

2.3 LjFNS基因的組織特異性表達(dá)

分別提取金銀花幼葉、老葉、幼莖、綠蕾、白花和黃花的總RNA，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分析LjFNS基因在金銀花的莖、葉和花等不同組織以及幼葉、白花與黃花等不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)特性。由圖3可以看出，該基因在各個(gè)組織中均有表達(dá)，但在白花中的表達(dá)量最高，其次為綠蕾與幼葉中的表達(dá)量，在白花與黃花之間的表達(dá)量差異達(dá)到了顯著水平(P<0.05)。在幼莖中LjFNS基因表達(dá)量最低，黃花中LjFNS基因表達(dá)量明顯高于幼莖中的表達(dá)量，差異達(dá)到了顯著水平(P<0.05)。由結(jié)果可知，LjFNS在金銀花中的表達(dá)表現(xiàn)出組織表達(dá)特異性與時(shí)間表達(dá)特異性，該基因的表達(dá)可能與花的發(fā)育緊密相關(guān)。

3 討論

植物細(xì)胞色素 P450 是最大的酶家族之一[6]， 它們?cè)谥参锏纳L(zhǎng)發(fā)育與次生代謝過程中起著十分重要的作用，近年來，隨著對(duì)植物次生代謝機(jī)制研究的不斷深入，越來越多的P450蛋白陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，植物P450蛋白在植物次生代謝產(chǎn)物的合成、逆境生理的調(diào)控中的作用越來越被重視[7-9]。但至目前為止，有關(guān)植物細(xì)胞色素P450蛋白方面的研究仍主要集中于相關(guān)基因的克隆及基因功能預(yù)測(cè)等方面，在P450功能鑒定與轉(zhuǎn)基因方面的研究還相對(duì)較少，從已有的有關(guān)P450在植物次生代謝產(chǎn)物合成中的功能研究結(jié)果看出，植物P450主要參與生物堿、萜類、黃酮、脂肪酸等代謝產(chǎn)物的合成[10]，近年來有關(guān)植物P450參與的植物體內(nèi)代謝催化機(jī)制方面的研究也越來越多[11]。

細(xì)胞色素P450是一類含血紅素結(jié)合亞基的多功能氧化酶[12]，是分子量約為55 ku(40～60 ku)的血紅素-硫鐵蛋白，有1個(gè)特征性的血紅素結(jié)合區(qū)域，主要為其C末端存在FxxGxRxCxG序列(其中x表示任意氨基酸)[6]，通常依據(jù)此序列來判定未知蛋白是否屬于P450家族。P450在生物體內(nèi)主要以可溶性和與膜結(jié)合2種形態(tài)存在[13]，從目前已經(jīng)鑒定的植物P450蛋白來看，以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合型蛋白為主，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合型蛋白在氨基端有1個(gè)特征性的疏水性螺旋，該螺旋以亮氨酸為主，該螺旋將蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上[6]。黃酮合成酶屬于植物細(xì)胞色素P450單加氧酶家族，它可以通過催化使圣草素轉(zhuǎn)變?yōu)槟鞠菟?，在金銀花主要活性成分的合成中起著十分重要的作用[14]。

本研究采用改進(jìn)的染色體步移方法，首次從金銀花中克隆得到LjFNS的基因組和CDS序列，序列同源性分析表明，金銀花LjFNS基因編碼的CDS序列與擬南芥LOC9307309基因CDS序列相似度達(dá)89%。有研究表明，擬南芥LOC9307309屬于細(xì)胞色素P450家族，它在調(diào)節(jié)植物器官發(fā)育方面起著非常重要的作用[15-16]；還有研究表明，P450表達(dá)量的高低與黃酮類成分含量緊密相關(guān)[17]，推測(cè)LjFNS基因的表達(dá)可能參與調(diào)控金銀花黃酮類成分的合成。在本研究中采用qPCR的方法對(duì)LjFNS在金銀花中的組織表達(dá)特異性與時(shí)間特異性的分析結(jié)果顯示，LjFNS在白花中的表達(dá)量最高，該基因的表達(dá)可能與花的發(fā)育緊密相關(guān)。本研究從金銀花中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)新的細(xì)胞色素P450家族成員并進(jìn)行了相關(guān)功能預(yù)測(cè)的表達(dá)特性分析，為進(jìn)一步開展LjFNS在金銀花的發(fā)育與有效成分合成過程中的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

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