葉維霞 郭建紅

（瀘州市人民醫(yī)院消化內科 四川 瀘州 646000）

結腸癌是全球常見的消化道惡性腫瘤之一，盡管其臨床治療方案不斷提高，但由于缺乏有效的靶向治療，死亡率仍居高不下[1]。因此，尋找到結腸癌有效的治療靶點仍是當前的一個研究課題。MicroRNA(miRNA)是為一組內源性的非編碼小分子RNA，可在轉錄后水平上調控基因的表達[2]。近年來多項研究證實miR-197在多種腫瘤中表達異常，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[3]。由此，本研究初步檢測了miR-197在結腸癌細胞及組織中的表達，為下一步探討 miR-197在結腸癌中所發(fā)揮的生物學功能奠定基礎。

1.材料和方法

1.1 主要材料

收集2016年8月至2017年3月我院肛腸科結腸癌手術標本14例，每例包括結腸癌組織及對應癌旁組織（均得到病理診斷證實）。結腸癌細胞株HCT116、SW480、SW620、Lovo購買于上海生命科學研究院細胞庫。TRlZOl試劑購自Invitrogen公司，反轉錄試劑盒購自Vazyme公司，Taqman MicroRNA Assay購自ABI公司。

1.2 研究方法

1.2.1 結腸癌細胞的培養(yǎng)

在結腸癌細胞株HCT116、SW480、SW620、Lovo中加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，至37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，每2～3d換液，用0.25胰酶消化傳代。

1.2.2 RNA提取及質量檢測

按說明書用Trizol法分別提取4組結腸癌細胞株、14例結腸癌及對應癌旁組織中的RNA。采用紫外分光光度儀測定總RNA的純度和濃度。

1.2.3 熒光定量RT-PCR

取1ugRNA按逆轉錄說明書將其逆轉錄為cDNA。按Tapman MicroRNA Assay說明以miR-197和RNU6B作模板，miR-197和RNU6B熒光探針作引物擴增，反應條件為，預變性：95℃10min；變性：95℃ 10s，退火，60℃ 20s，延伸，72℃ 34s，擴增40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt計算miR-197的相對表達量。所有實驗均重復3次，計算平均值。

1.3 miR-197靶基因的初步研究

我們利用生物信息學預測網(wǎng)站TargetScan、Pictar、microRNA.org預測miR-197作用的靶基因，通過取三者交集，預測出miR-197得分較高的靶基因。

1.4 統(tǒng)計學處理

所有試驗結果運用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗對數(shù)據(jù)進行比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2.結果

2.1 miR-197在結腸癌細胞株的表達

利用qRT-PCR結果發(fā)現(xiàn)miR-197在低轉移能力的結直腸癌細胞株HCT116、SW480中的表達高于高轉移能力的SW620和Lovo細胞株（P＜0.05），如圖1。

圖1 miR-197在4種結腸癌細胞株的表達

2.2 miR-197在結腸癌組織中的表達

利用qRT-PCR結果發(fā)現(xiàn)miR-197在14例結腸癌組織中，除6號、14號外，有12例在癌旁組織中的表達水平均明顯高于相應癌組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），如圖2。

圖2 miR-197在結直腸癌組織和相配對正常組織中的表達

2.3 miR-197靶基因的預測

miRNA預測網(wǎng)站對miR-197靶基因預測結果顯示，Pictar：99個，TargetScan：140個，microRNA.org：7644個，綜合三者的交集，我們取分值較高且有大量研究與腫瘤相關密切的的三個靶基因，即ETF1、SYNGR1、ZIC3作為后續(xù)研究對象，如圖3。

圖3 miRNA預測網(wǎng)站靶基因示意圖

3.討論

結腸癌難以治愈、易出現(xiàn)轉移，因此尋找有效的靶基因并探討其功能，不僅有利于闡明結腸癌發(fā)生的分子機理，還能為臨床診治、預后判斷提供新的靶點。

miRNA是一類大小約21～25個堿基的非編碼微小RNA。研究發(fā)現(xiàn)miRNA通過靶向調控原癌基因或抑癌基因，發(fā)揮著促癌作用或抑癌作用，參與腫瘤生長、轉移、血管生成等多種過程[4]。最近發(fā)現(xiàn)miR-197序列在多種物種間有高度保守性，提示它可能存在較強大的生物信息學功能。大量研究也證實了這一點，在肝癌、甲狀腺濾泡癌、惡性星形膠質細胞瘤、男性乳腺癌、肺癌的篩查過程中發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中miR-197的表達顯著上調[5]。由此，本課題應用qRT-PCR技術檢測了miR-197在結腸癌細胞及組織中的表達情況。結果發(fā)現(xiàn)miR-197在低轉移能力的結腸癌細胞株HCT116、SW480中的表達高于高轉移能力的SW620和Lovo細胞株，同時在14例結腸癌組織中，有12例在癌旁組織中的表達水平均明顯高于對應結腸癌組織，只有兩例6號、14號的表達情況相反，這可能是個體差異造成的。由此，我們初步得出miR-197很可能參與了結腸癌的發(fā)生發(fā)展過程，但具體機制尚不清楚。我們通過miRNA預測網(wǎng)站對miR-197靶基因進行預測，結果顯示Pictar：99個，TargetScan：140個，microRNA.org：7644個，綜合三者的交集，我們選取了分值較高且與腫瘤相關密切的的三個靶基因，即ETF1、SYNGR1、ZIC3作為后續(xù)研究對象。

綜上所述，本研究初步發(fā)現(xiàn)了miR-197在結腸癌細胞及組織中的表達差異，提示它可能在結直腸癌發(fā)展過程中作為抑癌基因起作用，通過生物信息學預測它可能是通過靶向調控ETF1、SYNGR1、ZIC3的表達來實現(xiàn)。

[1]Zheng Z X, Zheng R S, Zhang S W, et al. Colorectal cancer incidence and mortality in China, 2010[J]. Asian Pac Cancer Prev, 2014, 15(19): 8455-8460.

[2]Calin GA, Croce CM. MicroRNA signatures in human cancers[J]. Nature Reviews Cancer. 2006, 6(11): 857-866.

[3]Hamada S, Satoh K, Miura S, et al. MiR-197 induces epithelial-mesenchymal transition in pancreatic cancer cells by targeting p120 catenin[J]. J Cell Physiol. 2013, 228(6):1255-1263.

[4]Ai RT,Wu SY, Wen XY, et al. 1,3,4-tri-O-galloyl-6-O-caffeoyl-β-D-glucopyranose, a new anti-proliferative ellagitannin, regulates the expression of microRNAs in HepG(2) cancer cells[J]. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao.2011, 31(10):1641-1648.