葉維霞 郭建紅

（瀘州市人民醫(yī)院消化內(nèi)科 四川 瀘州 646000）

結(jié)腸癌是全球常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，盡管其臨床治療方案不斷提高，但由于缺乏有效的靶向治療，死亡率仍居高不下[1]。因此，尋找到結(jié)腸癌有效的治療靶點(diǎn)仍是當(dāng)前的一個(gè)研究課題。MicroRNA(miRNA)是為一組內(nèi)源性的非編碼小分子RNA，可在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因的表達(dá)[2]。近年來(lái)多項(xiàng)研究證實(shí)miR-197在多種腫瘤中表達(dá)異常，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。由此，本研究初步檢測(cè)了miR-197在結(jié)腸癌細(xì)胞及組織中的表達(dá)，為下一步探討 miR-197在結(jié)腸癌中所發(fā)揮的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1.材料和方法

1.1 主要材料

收集2016年8月至2017年3月我院肛腸科結(jié)腸癌手術(shù)標(biāo)本14例，每例包括結(jié)腸癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織（均得到病理診斷證實(shí)）。結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116、SW480、SW620、Lovo購(gòu)買于上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)。TRlZOl試劑購(gòu)自Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Vazyme公司，Taqman MicroRNA Assay購(gòu)自ABI公司。

1.2 研究方法

1.2.1 結(jié)腸癌細(xì)胞的培養(yǎng)

在結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116、SW480、SW620、Lovo中加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，至37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2～3d換液，用0.25胰酶消化傳代。

1.2.2 RNA提取及質(zhì)量檢測(cè)

按說(shuō)明書(shū)用Trizol法分別提取4組結(jié)腸癌細(xì)胞株、14例結(jié)腸癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織中的RNA。采用紫外分光光度儀測(cè)定總RNA的純度和濃度。

1.2.3 熒光定量RT-PCR

取1ugRNA按逆轉(zhuǎn)錄說(shuō)明書(shū)將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按Tapman MicroRNA Assay說(shuō)明以miR-197和RNU6B作模板，miR-197和RNU6B熒光探針作引物擴(kuò)增，反應(yīng)條件為，預(yù)變性：95℃10min；變性：95℃ 10s，退火，60℃ 20s，延伸，72℃ 34s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt計(jì)算miR-197的相對(duì)表達(dá)量。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，計(jì)算平均值。

1.3 miR-197靶基因的初步研究

我們利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)網(wǎng)站TargetScan、Pictar、microRNA.org預(yù)測(cè)miR-197作用的靶基因，通過(guò)取三者交集，預(yù)測(cè)出miR-197得分較高的靶基因。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有試驗(yàn)結(jié)果運(yùn)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 miR-197在結(jié)腸癌細(xì)胞株的表達(dá)

利用qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-197在低轉(zhuǎn)移能力的結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116、SW480中的表達(dá)高于高轉(zhuǎn)移能力的SW620和Lovo細(xì)胞株（P＜0.05），如圖1。

圖1 miR-197在4種結(jié)腸癌細(xì)胞株的表達(dá)

2.2 miR-197在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)

利用qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-197在14例結(jié)腸癌組織中，除6號(hào)、14號(hào)外，有12例在癌旁組織中的表達(dá)水平均明顯高于相應(yīng)癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），如圖2。

圖2 miR-197在結(jié)直腸癌組織和相配對(duì)正常組織中的表達(dá)

2.3 miR-197靶基因的預(yù)測(cè)

miRNA預(yù)測(cè)網(wǎng)站對(duì)miR-197靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，Pictar：99個(gè)，TargetScan：140個(gè)，microRNA.org：7644個(gè)，綜合三者的交集，我們?nèi)》种递^高且有大量研究與腫瘤相關(guān)密切的的三個(gè)靶基因，即ETF1、SYNGR1、ZIC3作為后續(xù)研究對(duì)象，如圖3。

圖3 miRNA預(yù)測(cè)網(wǎng)站靶基因示意圖

3.討論

結(jié)腸癌難以治愈、易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，因此尋找有效的靶基因并探討其功能，不僅有利于闡明結(jié)腸癌發(fā)生的分子機(jī)理，還能為臨床診治、預(yù)后判斷提供新的靶點(diǎn)。

miRNA是一類大小約21～25個(gè)堿基的非編碼微小RNA。研究發(fā)現(xiàn)miRNA通過(guò)靶向調(diào)控原癌基因或抑癌基因，發(fā)揮著促癌作用或抑癌作用，參與腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、血管生成等多種過(guò)程[4]。最近發(fā)現(xiàn)miR-197序列在多種物種間有高度保守性，提示它可能存在較強(qiáng)大的生物信息學(xué)功能。大量研究也證實(shí)了這一點(diǎn)，在肝癌、甲狀腺濾泡癌、惡性星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤、男性乳腺癌、肺癌的篩查過(guò)程中發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中miR-197的表達(dá)顯著上調(diào)[5]。由此，本課題應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了miR-197在結(jié)腸癌細(xì)胞及組織中的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-197在低轉(zhuǎn)移能力的結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116、SW480中的表達(dá)高于高轉(zhuǎn)移能力的SW620和Lovo細(xì)胞株，同時(shí)在14例結(jié)腸癌組織中，有12例在癌旁組織中的表達(dá)水平均明顯高于對(duì)應(yīng)結(jié)腸癌組織，只有兩例6號(hào)、14號(hào)的表達(dá)情況相反，這可能是個(gè)體差異造成的。由此，我們初步得出miR-197很可能參與了結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，但具體機(jī)制尚不清楚。我們通過(guò)miRNA預(yù)測(cè)網(wǎng)站對(duì)miR-197靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示Pictar：99個(gè)，TargetScan：140個(gè)，microRNA.org：7644個(gè)，綜合三者的交集，我們選取了分值較高且與腫瘤相關(guān)密切的的三個(gè)靶基因，即ETF1、SYNGR1、ZIC3作為后續(xù)研究對(duì)象。

綜上所述，本研究初步發(fā)現(xiàn)了miR-197在結(jié)腸癌細(xì)胞及組織中的表達(dá)差異，提示它可能在結(jié)直腸癌發(fā)展過(guò)程中作為抑癌基因起作用，通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)它可能是通過(guò)靶向調(diào)控ETF1、SYNGR1、ZIC3的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。

[1]Zheng Z X, Zheng R S, Zhang S W, et al. Colorectal cancer incidence and mortality in China, 2010[J]. Asian Pac Cancer Prev, 2014, 15(19): 8455-8460.

[2]Calin GA, Croce CM. MicroRNA signatures in human cancers[J]. Nature Reviews Cancer. 2006, 6(11): 857-866.

[3]Hamada S, Satoh K, Miura S, et al. MiR-197 induces epithelial-mesenchymal transition in pancreatic cancer cells by targeting p120 catenin[J]. J Cell Physiol. 2013, 228(6):1255-1263.

[4]Ai RT,Wu SY, Wen XY, et al. 1,3,4-tri-O-galloyl-6-O-caffeoyl-β-D-glucopyranose, a new anti-proliferative ellagitannin, regulates the expression of microRNAs in HepG(2) cancer cells[J]. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao.2011, 31(10):1641-1648.