◎ 關正萍，王君偉，許江彬，關 正

（1.山西師范大學食品科學學院，山西 臨汾 041000；2.山西師范大學現(xiàn)代文理學院，山西 臨汾 041000）

吡蟲啉是用來保護植物蔬菜防止害蟲侵害的，它可以消滅多種傷害植物的蟲子[1]。近幾年，吡蟲啉的添加量不斷增長，果蔬中的殘留情況得到了人們的關注[1]，但吡蟲啉在海紅果中殘留的檢測方法還沒有出現(xiàn)[1]。

海紅果樹，它是一類抗旱、抗寒、產(chǎn)量高的樹，但在國內(nèi)卻是比較少有的果樹種類。它最開始產(chǎn)自秦晉蒙交界處，品質(zhì)優(yōu)良[2]。海紅果營養(yǎng)價值高，海紅果實具有鮮食、干制等用途，同時具有增進食欲等功能，特別對兒童以及老年缺鈣的癥狀具有良好的食療作用。用其制成的食品特別受百姓青睞，具有經(jīng)濟開發(fā)潛力。

超聲波輔助提煉結(jié)合HPLC采取超聲波幫助溶劑來提煉，這種方法可減少提煉時間，提高提煉率[3]。而我國還未出現(xiàn)明確檢測海紅果中吡蟲啉含量的方式。為此，本試驗設計超聲波輔助提取HPLC來檢測海紅果中的吡蟲啉的殘留情況。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

主要材料：吡蟲啉標準品100 μg/mL、乙腈（色譜純）、氨基柱(500 mg/3 mL)，均購置于沃克化學儀器單位；干制海紅果，市售；哇哈哈飲用純凈水，超市購置。

主要儀器：Agilent 1260高效液相色譜儀，菲爾伯恩實業(yè)發(fā)展（上海）有限公司；KQ-300E型超聲波清洗器，合肥攀升超聲波科技有限公司；Vortex Genie2T漩渦混合器，上海利聞科學儀器有限公司；GTR21-1高速冷凍離心機，基因有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海汗諾儀器有限公司；HP-01真空泵，邦西儀器科技（上海）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜分析條件的優(yōu)化

（1）檢測波長的優(yōu)化。查找國家標準GB/T23379-2009來確定吡蟲啉的紫外吸收光譜為270 nm[4]。

（2）流動相的優(yōu)化。甲醇溶液：色譜級甲醇溶液1 000 mL，用0.22 μm的有機濾膜于抽濾裝置中過濾，在功率為800 W、水溫30 ℃的條件下超聲處理20 min，存儲備用。超純水：選用哇哈哈飲用純凈水，用0.22 μm的水系濾膜于抽濾裝置中過濾，在功率為800 W、水溫為30 ℃的條件下超聲處理20 min，存儲備用。此次試驗選擇甲醇和水的比例分別為：甲醇∶水=85∶15（V/V）、甲醇∶水=80∶20（V/V）、甲醇∶水=75∶25（V/V）、甲醇∶水=70∶30（V/V）、甲醇∶水=65∶35（V/V）。通過對照5種差異色譜進樣中帶著被測組分前進運動的物質(zhì)的配比分析圖來確定最優(yōu)甲醇和水的比例[2]。

（3）流動相流速的優(yōu)化。試驗選擇的進樣速度分別設置為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL/min。通過比較5種不同進樣速度的分析圖來確定最優(yōu)流動相流速[2]。

（4）色譜柱溫度的優(yōu)化。此次試驗選擇的色譜柱溫度分別設置為20、25、30、35、40 ℃，通過對照5種不同色譜柱溫度的色譜圖來確定最優(yōu)色譜柱溫度[2]。

1.2.2 正交試驗

以單因素試驗結(jié)果為基礎，以色譜柱溫度（C）、進樣液體速度（B）、流動相比例（A）為影響因素，以色譜圖峰面積、對稱因子為指標，進行正交試驗。確定最優(yōu)色譜條件組合。

1.2.3 標準曲線的繪制

將標準液配制成0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/mL的標準曲線。首先分別移取0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mL，10.0 μg/mL吡蟲啉標準品于1 mL進樣瓶里面，并用甲醇溶液添加至1 mL，用高效液相色譜儀進行檢測，將檢測的峰面積對應相應的濃度繪制吡蟲啉的標準曲線，求出線性回歸方程[1]。

1.2.4 系統(tǒng)重現(xiàn)性的確定

選擇曲線中間點濃度為2.0 μg/mL的吡蟲啉樣品，重復進樣5次，檢查儀器系統(tǒng)的穩(wěn)定性[3]。

1.2.5 回收率的測定

（1）制樣。取無病蟲害、無損壞的干制海紅果可食部分，用純凈水浸泡6 h，粉碎并混合均勻[5-6]。

（2）提取。稱取海紅果樣品4 g（精確至0.01 g）。取10 mL乙腈加到海紅果里面，加上面配制好的溶液，讓其含量依次為0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/kg[2]。同時，設置平行樣與空白對照。用超聲波處理15 min以后，加入2.0 g的氯化鈉，均勻混合10 min，固液分離10 min（5 000 r/min），然后吸5 mL有機溶劑于新的心型瓶中，在溫度為40 ℃的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋干。

（3）凈化。激發(fā)凈化柱用5 mL甲醇∶二氯甲烷（5∶95），溶解殘渣用2 mL甲醇∶二氯甲烷（5∶95），反復3回進到活化柱，接到雞心瓶中。洗脫用5 mL甲醇∶二氯甲烷（5∶95），全部接收于雞心瓶中。40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，旋干。加5 mL甲醇置換，混勻，旋干[2]。然后用1 mL甲醇解殘渣[2]。

（4）過膜。將1 mL溶解殘渣的甲醇過0.2 μm的有機濾膜[2]。

（5）檢測。HPLC檢測[2]。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的建立

2.1.1 檢測波長的確定

借助GB/T23379-2009，發(fā)覺其最大吸收出現(xiàn)在270 nm處，因此波長選擇270 nm。

2.1.2 流動相配比的確定

此次試驗選擇的流動相分別為：甲醇∶水=85∶15（V/V），甲醇∶水=80∶20（V/V），甲醇∶水=75∶25（V/V）甲醇∶水=70∶30（V/V），甲醇∶水=65∶35（V/V）。5種比例的流動相的檢測結(jié)果分別對應圖1a-圖1e。

圖1 流動相為甲醇∶水（V/V）對標準液測量結(jié)果圖

檢測條件：①檢測樣品，吡蟲啉標準液10.0 μg/mL。②進樣液體速度，0.4 mL/min。③色譜柱溫度30 ℃。④檢測波長，270 nm。

由圖1a-圖1e可知：當流動相為甲醇∶水=85：15（V/V）、甲醇∶水=80∶20（V/V）、甲醇∶水=75∶25（V/V）的時候，雖能檢測出吡蟲啉這種物質(zhì)，但峰型對稱度不高，并且未出現(xiàn)溶劑峰。后經(jīng)檢測得知當以甲醇∶水=65∶35（V/V）檢測時，出峰的時間靠中，峰形對稱。當以甲醇∶水=70∶30（V/V）檢測的時候，保留時間適中，峰形對稱性更高，溶劑峰與吡蟲啉峰型分開，并且沒有托峰，所以擇優(yōu)選擇甲醇∶水=70∶30（V/V）作為此次試驗的色譜進樣中帶著被測組分前進運動的物質(zhì)[7]。

2.1.3 流動相流速的確定

試驗選擇的進樣液體的速度分別設置為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL/min（結(jié)果分別對應圖2a-圖2e）[8]。不同進樣速度的測量結(jié)果，如圖2所示。

圖2 流速對標準液檢測結(jié)果圖

檢測條件：①檢測樣品名稱，吡蟲啉標準液10.0 μg/mL。②流動相為甲醇∶水=65∶35（V/V）。③色譜柱度30 ℃。④檢測波長，270 nm。

由圖2可知，當色譜過程中攜帶待測組分向前移動的物質(zhì)的速度為0.2 mL/min的時候，峰形對稱性不好且保留時間太長；當色譜過程中攜帶待測組分向前移動的物質(zhì)的速度為0.4 mL/min的時候，其保留時間短，分離度較好，并且峰形對稱性好，無尾峰；當色譜過程中攜帶待測組分向前移動的物質(zhì)的速度為0.6、0.8、1.0 mL/min的時候，保留時間雖短，但是對稱度不高。綜合考慮，選擇色譜過程中攜帶待測組分向前移動的物質(zhì)的速度為0.4 mL/min[2]。

2.1.4 色譜柱溫度的確定

此次試驗選擇的色譜柱溫度分別設置為20、25、30、35、40 ℃（結(jié)果分別對應圖3a-圖3e）。如圖3所示[9]。

圖3 柱溫對標準液分析結(jié)果圖

檢測條件：①檢測波長，270 nm。②檢測樣品，吡蟲啉標準液10.0 μg/mL。③流動相為甲醇∶水=65∶35（V/V）。④流速，0.4 mL/min。

由圖3a可知，在本試驗中，柱溫對保留時間、分離度等的影響并不是非常大。綜合考慮，選擇柱溫30 ℃[2]。

2.2 正交實驗

以單因素試驗結(jié)果為基礎，以柱溫（C）、進樣液體速度（B）、不同色譜過程中攜帶待測組分向前移動的物質(zhì)比例（A）為影響因素，用峰面積和對稱因子當指標，進行正交試驗。正交實驗的因素與水平，見表1。

表1 L9（33）正交試驗因素和水平表

2.2.1 正交結(jié)果的方差分析表

選擇曲線中間點濃度為2.0 μg/mL的吡蟲啉樣品，采用L9（33）正交試驗來確定實驗最佳工藝條件，結(jié)果見表2。

表2 L9（33）正交試驗結(jié)果分析表

正交試驗極差分析闡明，3個因素對吡蟲啉色譜圖的作用次序為ABC，即流動相的比例＞流速＞柱溫，最佳組合為A2B2C3，即當流動相比例為甲醇∶水=70∶30（V/V），流動相的流速為0.4 mL/min，柱溫35 ℃時，峰面積最接近測量值。但由正交表選擇的最理想組合與色譜條件優(yōu)化的理想組合A2B2C2不相同，所以對以上兩個組合再進行驗證實驗。

2.2.2 最優(yōu)配方選擇驗證實驗

由于正交表中的最優(yōu)組合與色譜條件優(yōu)化最優(yōu)組合有差異，故需進行驗證實驗來保證實驗結(jié)果的準確性。選擇曲線中間點濃度為2.0 μg/mL的樣品，分別以A2B2C2與A2B2C3這兩組色譜條件組合進行驗證，峰面積最接近被測值的為此次最優(yōu)組合。驗證實驗結(jié)果，見表3。

表3 最優(yōu)配方選擇驗證實驗表

表3表明：用A2B2C2這一組合的峰面積最接近測量值，所以此次實踐的最優(yōu)組合為A2B2C2。當流動相比例為甲醇∶水=70∶30（V/V），流速為0.4 mL/min，色譜柱溫度30 ℃時，峰面積最接近測量值，對稱性高。

2.3 標準曲線和檢出限

將標準液配制成0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/mL標準曲線樣液，求出標準曲線的回歸方程為y=75.754x+9.170 6及相關系數(shù)是0.999 2[10-11]。結(jié)果如圖4所示。

圖4 標準曲線圖

分析圖4可知，本方法定量限為0.05 mg/kg，完全符合國內(nèi)外規(guī)定殘留最高值（MRL）[1]。

2.4 系統(tǒng)的重現(xiàn)性

選擇曲線中間點濃度為2.0 μg/mL的吡蟲啉樣品，重復進樣5次，檢查儀器系統(tǒng)的穩(wěn)定性[12-13]。檢測結(jié)果，見表4。由表4可知，吡蟲啉峰面積依次為163.4、160.7、165、164.5、167.2，平均峰面積164.16，說明系統(tǒng)重復性較好。

表4 重復進樣系統(tǒng)精密度表

2.5 海紅果中吡蟲啉的回收率

使各樣品中吡蟲啉的含量分別為0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/kg[14-15]。同時設置3組平行樣與空白對照[2]。結(jié)果見表5。

表5 海紅果農(nóng)藥殘留量的回收率和變異系數(shù)表（n=10）

當海紅果中吡蟲啉的添加量分別為0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/kg時，平均回收率分別為86.76%、87.65%、92.75%、86.45%、93.65%， 變 異 系 數(shù) 為1.23%～2.4%。結(jié)果表明，相對標準偏差＜5，在允許范圍內(nèi)[10]，達到農(nóng)藥殘留分析的條件[16-17]。

3 結(jié)論

此試驗為快速檢測海紅果吡蟲啉的農(nóng)藥殘留研究。首先進行色譜條件的優(yōu)化，色譜柱溫度30 ℃；流動相配比為甲醇∶水=70∶30（V/V），檢測波長270 nm，流動相流速0.4 mL/min。然后進行標準曲線的繪制以及系統(tǒng)重現(xiàn)性和回收率的測定。結(jié)果表明：當添加水平在0.25～4.0 mg/kg時，回收率均在80%～120%，相對標準偏差＜5；該方法的定量出現(xiàn)的最小值為0.05 mg/kg，標準曲線線性關系數(shù)0.999 2。因此，本試驗檢測更準確、訊速、靈敏，可作為果蔬中吡蟲啉檢測的技術(shù)支持。

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