文娟娟 瞿 兵 劉 超

肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率占惡性腫瘤死亡率的第二位[1-2]。肝癌起病隱匿，大多數(shù)患者初次診斷時，便已進入中晚期，預后較差。對于未轉(zhuǎn)移病例，手術(shù)切除和肝移植是肝癌根治的主要治療方法。肝癌發(fā)生發(fā)展機制已研究多年，但發(fā)病機制仍不清楚。肝炎病毒感染、長期飲酒等因素導致的多基因異常與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。因此，從基因水平研究肝癌病理機制對明確肝癌發(fā)病、提高早期診斷率、尋找治療靶點、改善預后至關(guān)重要。抗凝血酶Ⅲ(Antithrombin-Ⅲ，AT3)，又稱作絲氨酸蛋白酶抑制劑C家族成員1(Serpin family C member 1，SERPINC1)，是血漿中一種蛋白酶抑制劑，具有抗凝血功能。研究報道，手術(shù)前AT3水平與肝癌根治性切除術(shù)后的生存率密切相關(guān)，且給予AT3可以降低肝癌切術(shù)術(shù)后肝衰竭發(fā)生率[4-5]，提示AT3可能參與了肝癌的病理機制。目前，尚無研究系統(tǒng)論述肝癌組織中AT3表達的臨床意義。為此，本研究利用公共數(shù)據(jù)庫中肝癌基因表達譜及相應臨床數(shù)據(jù)，探討肝癌組織中AT3表達水平與其臨床特征及預后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 收集數(shù)據(jù)資料

從GEO(Gene Expression Omnibus)公共數(shù)據(jù)庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)中下載肝癌基因表達譜及相關(guān)臨床數(shù)據(jù)(GSE14520)。GSE14520包含兩個芯片平臺，分別為Affymetrix HT Human Genome U133A Array(GPL3921)和Affymetrix Human Genome U133A 2.0 Array(GPL571)。應用GPL3921和GPL571平臺檢測肝癌組織的病例數(shù)分別為220例和22例。所有標本提取RNA后，經(jīng)過生物素標記后與芯片雜交，采用GeneChip scanner 3000掃描，應用GCOS1.0進行初步分析。本研究為了排除平臺差異，僅選用GPL3921平臺檢測的220例肝癌數(shù)據(jù)。

1.2 數(shù)據(jù)篩選及分組

220例肝癌病例中，排除6例臨床數(shù)據(jù)缺失的病例，保留214例臨床數(shù)據(jù)完整的病例。臨床數(shù)據(jù)中，所有病例的腫瘤轉(zhuǎn)移風險是根據(jù)其標本中分子指紋(Gene signature)的表達情況來確定，該分子指紋是由Roessler等發(fā)現(xiàn)的161個基因的表達譜所組成[6]?；虮磉_譜中，所有基因的相對表達量均以探針信號強度以2為底數(shù)對數(shù)化后的值衡量。AT3基因?qū)臋z測探針為210049_at，為特異性探針。根據(jù)探針號，提取214例樣本對應的AT3基因表達數(shù)據(jù)，然后根據(jù)該基因的表達水平進行由高到低排序后，前50%的樣本(n=107)作為高表達組，后50%的樣本(n=107)作為低表達組。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件和GraphPad 5進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料的單因素分析采用卡方檢驗。生存資料的單因素分析采用Log-rank檢驗，多因素分析采用Cox回歸分析，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

共214例肝癌病例納入研究，平均年齡50.7歲，男性占86.4%(185/214)，97例(45.3%)血清甲胎蛋白含量大于300 ng/mL，87例(40.7%)病例血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)含量大于50 U/L，77例(36.0%)腫瘤直徑大于5 cm，44例(20.6%)多發(fā)結(jié)節(jié)，197例(92.1%)合并肝硬化，TNM分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期分別有89、77、48例(41.6%、36.0%、22.4%)，103例(48.1%)具有轉(zhuǎn)移高風險。

2.2 肝癌組織AT3基因表達水平及其與臨床特征的關(guān)系

單因素分析發(fā)現(xiàn)，AT3低表達組中，血清AFP含量較高(P<0.001)，腫瘤體積較大(P=0.015)，TNM分期較差(P=0.001)，轉(zhuǎn)移風險較高(P<0.001)，而年齡、性別、血清ALT含量、結(jié)節(jié)數(shù)目、合并肝硬化等因素與AT3基因表達水平無顯著性關(guān)系(P>0.05)(表1)。

2.3 肝癌預后影響因素分析

214例患者中位隨訪時間為51.5個月，共84例患者死亡。單因素生存分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤體積較大(P=0.023)、多發(fā)結(jié)節(jié)(P=0.047)、合并肝硬化(P=0.016)、TNM分期較差(P<0.001)、高轉(zhuǎn)移風險(P=0.001)及AT3低表達(P=0.005)與肝癌患者預后有關(guān)(圖1，表2)。多因素Cox回歸分析亦提示AT3表達水平是肝癌患者預后的獨立影響因素(HR=0.850，95%CI：0.745～0.970，P=0.016)(表3)。

圖1 肝癌組織中抗凝血酶III基因不同表達水平的生存曲線Figure 1 Survival curves of HCC patients with low or high expression of AT3

表1 肝癌組織抗凝血酶III基因(AT3)表達水平及其與臨床特征關(guān)系

Note：AFP：alpha-fetoprotein；ALT：alanine aminotransferase.

表3 肝癌預后影響因素的多因素分析

表2 肝癌預后影響因素的單因素分析

3 討論

抗凝血酶Ⅲ基因又稱作絲氨酸蛋白酶抑制劑C家族成員1(Serpin family C member 1，SERPINC1)，位于人第1號染色體q25.1區(qū)域，由八個外顯子構(gòu)成。該基因編碼的蛋白質(zhì)含416個氨基酸，是血漿中一種蛋白酶抑制劑，可以抑制凝血酶和凝血系統(tǒng)中其它激活的絲氨酸蛋白酶，調(diào)控凝血與抗凝血平衡。基因本體發(fā)現(xiàn)，該基因不僅能抑制內(nèi)肽酶活性，還可以結(jié)合蛋白酶、肝素、黏多糖以及含硫化合物，主要參與凝血相關(guān)生物過程，也參與炎癥反應的調(diào)節(jié)。

目前，關(guān)于AT3的研究主要集中在凝血系統(tǒng)疾病，在肝癌中研究不多。Asmal等發(fā)現(xiàn)AT3可以抑制感染細胞株的丙肝病毒，同時下調(diào)與肝硬化、肝癌相關(guān)的多個宿主細胞信號轉(zhuǎn)導因子，包括Jun、Myc和BMP2[7]。Mizuquchi等對158例首次肝癌切除術(shù)后的患者進行回顧性分析后發(fā)現(xiàn)，與ICGR15相比，術(shù)前血清AT3水平對術(shù)后肝功能異常/肝衰竭更有預測價值[8]。Iwako等將440例肝癌根治性切除術(shù)患者根據(jù)術(shù)前血AT3活性分成高低兩組(閾值70%)，分析發(fā)現(xiàn)術(shù)前AT3高活性組手術(shù)后，總體生存率和無病生存率均顯著高于低活性組(P=0.005；P=0.011)，多因素分析亦提示相同結(jié)果[4]。Kuroda等對肝癌切除術(shù)后患者給予靜脈AT3治療后，與對照組相比，治療組肝衰竭發(fā)生率顯著低于對照組(16.3%vs. 44.2%，P<0.01)[5]。相關(guān)研究報道顯示血清AT3水平下降是結(jié)腸癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌等腫瘤復發(fā)和預后的危險因子[9-10]。這些研究均提示AT3在肝癌中可以起到抑癌作用，與本研究結(jié)論一致。

關(guān)于AT3在腫瘤中的作用機制較為復雜。有研究報道AT3與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移相關(guān)。Kurata等發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌大鼠模型中，AT3可以阻止肝缺血再灌注導致的結(jié)腸癌細胞轉(zhuǎn)移[11]。AT3在肝癌中的作用機制主要與調(diào)控其靶點蛋白的腫瘤生物學活性相關(guān)。首先，巨噬細胞抑制因子(Macrophage inhibitory factor，MIF)是AT3的作用靶點之一，參與了多種腫瘤細胞的增殖和浸潤，而AT3可以通過與MIF形成復合物來降低MIF的生物活性[12]。其次，AT3的另一底物凝血酶可促進多個腫瘤相關(guān)病理過程，如腫瘤細胞-血小板黏附、腫瘤細胞組織浸潤和腫瘤血管生成等[13]。Kaufmann等[14]研究發(fā)現(xiàn)多種肝癌細胞系表達凝血酶受體，加入凝血酶后可以促進肝癌細胞遷移。第三，骨橋蛋白在肝癌細胞中高表達，并與肝癌的預后、早期復發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[15]。凝血酶可將骨橋蛋白分解成兩個相同大小的片段，這些片段可以通過激活整合素β-黏著斑激酶信號通路，促進肝癌細胞的增殖和黏附[16]。因此，AT3可以通過抑制凝血酶來調(diào)控肝癌的發(fā)生發(fā)展。

本研究通過公共數(shù)據(jù)庫中基因芯片的肝癌表達譜數(shù)據(jù)及相應臨床數(shù)據(jù)進行分析，確認了AT3表達在肝癌中的臨床意義。研究發(fā)現(xiàn)，AT3在肝癌中可能起到抑癌基因作用，與相關(guān)基礎研究結(jié)果一致，為該基因的進一步研究提供了理論基礎，同時，也為該基因應用于精準醫(yī)療診斷和治療提供了理論支持。其次，本研究共納入了214例標本，樣本量較大，臨床信息較全，彌補了相關(guān)領(lǐng)域研究樣本量小、臨床信息缺失的不足。

綜上所述，肝癌組織中，AT3表達水平與患者臨床特征及預后相關(guān)，其低表達可能是影響肝癌預后的危險因素之一。

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