段艷軍 徐 衛(wèi) 陳文杰 王鳳娟

口腔鱗狀細(xì)胞癌(Oral squamous cell carcinoma，OSCC)是最常見的口腔腫瘤類型，占全部口腔惡性腫瘤的90%，頭頸部腫瘤的38%，每年診斷超過50萬的新發(fā)病例[1]。Wnt信號通路是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的經(jīng)典途徑之一，ETC-159是Wnt信號通路的一個(gè)強(qiáng)效抑制劑，能有效抑制幾乎所有種類的Wnt蛋白的活性和分泌，同時(shí)已被證明在結(jié)直腸癌中有出色的療效，但是其作用機(jī)制尚不明確[2]。由于口腔鱗狀細(xì)胞癌治療手段相對匱乏，給患者及其家人帶來沉重的精神以及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此對口腔鱗狀細(xì)胞癌治療藥物的進(jìn)一步研究迫在眉睫。本研究擬通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，ETC-159能否影響口腔鱗癌細(xì)胞的增殖或遷移，并對其機(jī)制進(jìn)行一定的探討，為口腔鱗狀細(xì)胞癌治療藥物的開發(fā)提供新的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑

SCC-15細(xì)胞(屬于口腔鱗癌細(xì)胞系)購自中科院上海細(xì)胞庫，DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清FBS(Gibco公司)，CCK8試劑盒(碧云天公司)，二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司)，ETC-159(Med Chem Express，MCE)，Transwell小室(康寧公司)，Ripa細(xì)胞裂解液(碧云天)，兔抗Wnt3a、β-catenin、c-Myc、cyclin D1、CD146多克隆抗體和鼠抗DM1A單克隆抗體(Abcam公司，稀釋比均為1∶1 000)，熒光標(biāo)記的羊抗兔以及羊抗鼠二抗抗體(LI-COR公司，稀釋比均為1∶15 000)，PVDF膜(Hyclone公司)，抗體稀釋液(碧云天公司)。

1.2 CCK8檢測細(xì)胞增殖

將SCC-15細(xì)胞接種于96孔板，每孔約1×103個(gè)，每孔加入培養(yǎng)基100 μL，置37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，取24孔加入DMSO(每孔0.2 μL)(即DMSO組)，分別培養(yǎng)12 h(12孔)和24 h(12孔)，另取24孔加入ETC-159(DMSO稀釋至1.45 μΜ，每孔加入0.2 μL使其工作濃度為2.9 nM)(即ETC-159組)，分別培養(yǎng)12 h(12孔)和24 h(12孔)后換液(每孔加培養(yǎng)基90 μL)，同時(shí)加入CCK8反應(yīng)液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處的吸光度，每次檢測以加入培養(yǎng)基和反應(yīng)液的無細(xì)胞孔為空白對照。細(xì)胞增殖活性=(ETC-159組吸光度-空白對照吸光度)/(DMSO組吸光度-空白對照吸光度)。

1.3 Transwell小室檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)移

將Transwell小室放入24孔板，上室加入300 μL DMEM高糖培養(yǎng)基孵育25 min，吸凈培養(yǎng)基，細(xì)胞使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后制備懸液，取200 μL接種入Transwell上室，下室加入含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，分別使用DMSO和ETC-159處理細(xì)胞，培養(yǎng)12 h或24 h后擦去上室細(xì)胞和基質(zhì)膠，下室使用4%多聚甲醛處理20 min，之后使用1%結(jié)晶紫染色，鏡下觀察染色細(xì)胞，任選視野計(jì)數(shù)細(xì)胞，每組三孔，每孔6個(gè)視野。

1.4 Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)

當(dāng)細(xì)胞生長融合至80%左右時(shí)，將其分為三組進(jìn)行藥物處理：DMSO組(即DMSO處理24 h)，ETC-159處理12 h組(DMSO處理12 h后加入ETC-159處理12 h)，ETC-159處理24 h組(加入ETC-159處理24 h)。處理完成后，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌，加入RIPA裂解液4℃裂解15 min，刮取細(xì)胞，超聲裂解后離心取上清，將上清液與樣品緩沖液(50 mmol/L Tris·HCl(pH 7.6)、2%SDS、10%甘油、10 mmol/L DTT和0.2%溴酚藍(lán))混合，煮沸10 min，凝膠電泳分離蛋白質(zhì)(凝膠分為上部4% SDS-PAGE濃縮膠以及下部10% SDS-PAGE分離膠，電泳濃縮為每塊膠恒定電流10 mA，分離則為恒定電壓100 V)并轉(zhuǎn)移至PVDF膜(轉(zhuǎn)膜為恒定電流275 mA，時(shí)間為1 h)，5% BSA封閉30 min，一抗4℃孵育過夜，熒光標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，使用LI-COR公司Odyssey紅外熒光掃描成像儀顯色，使用Image J軟件進(jìn)行灰度分析，統(tǒng)計(jì)均為灰度值相對水平，即各組灰度值/DMSO組。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 ETC-159處理對SCC-15細(xì)胞增殖的影響

ETC-159處理12 h和24 h后SCC-15細(xì)胞的增殖活性與DMSO組相比均顯著性下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

表1ETC-159處理不同時(shí)間后SCC-15細(xì)胞增殖活性

Table1Proliferative activity of SCC-15 cells treated with ETC-159 for different time-point

Group12h24hDMSO1.001.00ETC-1590.87±0.16?0.64±0.13?

Note：*P<0.05，when compared to the DMSO group.

2.2 ETC-159處理對SCC-15細(xì)胞遷移能力的影響

Transwell小室實(shí)驗(yàn)觀察穿膜細(xì)胞數(shù)量發(fā)現(xiàn)在12 h以及24 h后ETC-159處理組SCC-15細(xì)胞的穿膜數(shù)量均顯著性低于DMSO處理組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

表2ETC-159處理后不同時(shí)間點(diǎn)SCC-15細(xì)胞穿膜數(shù)目

Table2Penetration number of SCC-15 cells treated with ETC-159 for different time-point

Group12h24hDMSO67±9 131±21ETC-15942±7? 79±17?

Note：*P<0.05，when compared to the DMSO group.

2.3 ETC-159處理對SCC-15細(xì)胞Wnt信號通路的影響

ETC-159處理12 h組和ETC-159處理24 h組中，SCC-15細(xì)胞中Wnt3a和β-catenin蛋白含量均顯著性下降，與DMSO組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

2.4 ETC-159處理對SCC-15細(xì)胞Wnt信號通路調(diào)節(jié)的部分增殖遷移相關(guān)蛋白的影響

ETC-159處理12 h組和ETC-159處理24 h組中SCC-15細(xì)胞中增殖相關(guān)蛋白c-Myc與cyclin D1以及遷移相關(guān)蛋白CD146含量均顯著性降低，與DMSO組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

圖1 ETC-159處理對SCC-15細(xì)胞Wnt信號通路的影響Figure 1 Effects of ETC-159 on the Wnt signaling pathway in SCC-15 cellsNote：A.The results of Western blot；B.Quantitative analysis of the blots(n=3).* P<0.05，when compared to the DMSO group.

圖2 ETC-159處理對SCC-15細(xì)胞部分增殖遷移相關(guān)蛋白的影響Figure 2 Effects of ETC-159 on the levels of c-Myc，cyclin D1，CD146 and DM1A in SCC-15 cellsNote：A.The results of Western blot；B.Quantitative analysis of the blots(n=3).* P<0.05，when compared to the DMSO group.

3 討論

Wnt信號通路的異常是多種惡性腫瘤的生物學(xué)特征，并且在許多癌癥類型腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起到重要作用[3]。在口腔鱗狀細(xì)胞癌中，Wnt蛋白下游信號β-catenin膜表達(dá)的喪失可能與其預(yù)后不良相關(guān)，并且被認(rèn)為是口腔鱗狀細(xì)胞癌復(fù)發(fā)的生物標(biāo)志物之一[4-5]。同時(shí)，DNA甲基化的表觀遺傳學(xué)沉默導(dǎo)致的Wnt拮抗相關(guān)蛋白(包括SFRP-2，WIF-1，DKK-1，DACH1和RUNX3)表達(dá)變化可能與口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生以及復(fù)發(fā)有著顯著性的關(guān)聯(lián)[6]。這些均提示W(wǎng)nt信號通路可能參與口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生。另外，Wnt信號負(fù)調(diào)控因子Dickkopf-1(Dkk1)的抑制能增加口腔鱗狀癌細(xì)胞的增殖和遷移[7]，而長非編碼RNA MEG3可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路減少口腔鱗癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[8]。因此，Wnt信號通路的抑制可能是口腔鱗狀細(xì)胞癌治療的一個(gè)有效的策略。

增殖和遷移能力的增加是腫瘤細(xì)胞最顯著的生理特征，也是影響其預(yù)后的重要因素，而能否對其進(jìn)行抑制則是腫瘤治療藥物的重要指標(biāo)[9]。Wnt信號通路可通過調(diào)節(jié)多種蛋白表達(dá)進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖和遷移，其中c-Myc是首個(gè)確認(rèn)受Wnt信號通路調(diào)節(jié)的原癌基因，參與癌細(xì)胞的增殖調(diào)控、分化和凋亡，cyclin D1則是調(diào)節(jié)細(xì)胞進(jìn)入增生期的細(xì)胞周期蛋白，Wnt信號通路能通過增加它們的表達(dá)從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，而CD146則是一種具備跨膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞黏附因子，Wnt信號通路已被證明在多種腫瘤細(xì)胞中通過激活其表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移[10-12]，而在口腔鱗癌細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了這些蛋白的表達(dá)[13-15]。

ETC-159是一種強(qiáng)效的口服PORCN抑制劑，能通過阻斷Wnt蛋白的脂肪?；揎椧种破浞置?，進(jìn)而抑制Wnt信號通路[2]。同時(shí)ETC-159已被證明在結(jié)直腸癌細(xì)胞中能有效抑制Wnt家族蛋白的表達(dá)進(jìn)而削弱Wnt信號通路最終抑制其增殖和遷移[2]。提示ETC-159可能通過抑制Wnt信號通路降低口腔鱗癌細(xì)胞的增殖和遷移能力進(jìn)而對其起到一定的治療效果。

本研究發(fā)現(xiàn)，ETC-159處理12 h和24 h后SCC-15細(xì)胞的增殖活性與DMSO組相比均有明顯的降低，使用Transwell小室觀察到ETC-159處理后SCC-15細(xì)胞遷移能力也顯著性降低，這些結(jié)果提示，ETC-159能有效抑制SCC-15細(xì)胞的增殖和遷移。ETC-159處理12 h組與24 h組中，Wnt家族蛋白Wnt3a含量均顯著性降低，進(jìn)一步提示ETC-159能夠抑制Wnt蛋白在SCC-15細(xì)胞中的表達(dá)，而Wnt蛋白是通過與其受體在細(xì)胞膜上的相互作用抑制GSK-3β誘導(dǎo)的β-catenin的磷酸化，從而導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中的積累，進(jìn)而激活Wnt信號通路，造成后續(xù)的影響[16]。因此，為進(jìn)一步確認(rèn)ETC-159對Wnt信號通路的影響，本研究還檢測了ETC-159處理12 h和24 h后細(xì)胞中β-catenin的含量，發(fā)現(xiàn)與DMSO組相比均顯著性降低，進(jìn)一步證明了ETC-159在SCC-15細(xì)胞中對Wnt信號通路的抑制。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)ETC-159處理12 h和24 h后的SCC-15細(xì)胞中，c-Myc、cyclin D1、CD146的含量均顯著性降低，也提示我們ETC-159可能通過降低c-Myc、cyclin D1以及CD146的表達(dá)抑制SCC-15細(xì)胞的增殖和遷移能力。

綜上所述，Wnt信號通路抑制劑ETC-159能通過降低c-Myc、cyclin D1以及CD146的水平抑制SCC-15細(xì)胞的增殖和遷移，提示ETC-159有可能作為一種新的藥物參與口腔鱗狀細(xì)胞癌的治療。但是由于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的局限性，ETC-159對口腔鱗狀細(xì)胞癌的治療作用是否能在體內(nèi)達(dá)到同樣的效果尚未可知，而且ETC-159對機(jī)體正常細(xì)胞是否具備毒副作用，其體內(nèi)應(yīng)用的適宜濃度、制劑方式以及作用的具體分子機(jī)制等問題，都有待進(jìn)一步研究。

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