張凡慶 陳玉雪 楊 亮 朱建國(guó)*

（1上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院/上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200240；2上海富朗特動(dòng)物保健股份有限公司，上海 201502）

豬傳染性胃腸炎（transmissible gastroenteritis）是由豬傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis virus,TGEV）感染引起的一種高度接觸性傳染病。該病臨床癥狀表現(xiàn)為水泄、嘔吐、脫水，甚至導(dǎo)致死亡[1]。2周齡的仔豬感染TGEV后立刻出現(xiàn)嘔吐，接著持續(xù)多天的腹瀉，嚴(yán)重的脫水使仔豬在感染后2～5天死亡。大于2周齡的豬感染TGEV后通常會(huì)康復(fù)，但是此后生長(zhǎng)速度緩慢，料肉比提高。TGEV由Doyle和Hutchin兩位學(xué)者在1946年首次在美國(guó)發(fā)現(xiàn)，我國(guó)在20世紀(jì)60年代報(bào)道了該病[2]。目前該病在全世界多個(gè)國(guó)家發(fā)生，并且該病經(jīng)常與豬輪狀病毒病、豬流行性腹瀉、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌病混合感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在我國(guó)，TGEV被列為國(guó)家B類傳染病，是我國(guó)重點(diǎn)防控的豬的疫病之一。

TGEV基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA，RNA具有感染性。病毒基因組大小約為28.5 kb，是已知基因組最大的RNA病毒，其5’端具有甲基化的帽子結(jié)構(gòu)，3’端具有共價(jià)結(jié)合的poly A尾。TGEV基因組分為7個(gè)區(qū)，除第1區(qū)和第3區(qū)分別具有2個(gè)開放閱讀框（open reading frames,ORFs） （ORF1a／ORF1b，ORF3a／ORF3b），其余每個(gè)區(qū)只有1個(gè)ORF（ORF2、ORF4、ORF6和 ORF7），排列順序?yàn)椋?’-ORF1a-ORF1b-ORF2-ORF3a-ORF3b-ORF4-ORF5-ORF6-ORF7-3’。ORF1a、ORF1b、ORF3a、ORF3b 和 ORF7分別編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，ORF1a和ORF1b編碼病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄聚合酶，ORF2、ORF4、ORF5、ORF6編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，分別為纖突蛋白（S）、小膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣殼蛋白（N）[3]。不同的病毒蛋白在病毒感染中發(fā)揮不同的作用。

單鏈抗體（single chain fragment variable,scFv）是一種基因工程抗體，它將抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通過一個(gè)短的柔性肽段連接[4]。scFv除了具有抗體的特異性和敏感性外，還具有分子量小、易于穿透細(xì)胞膜和半衰期短等特點(diǎn)。此外單鏈抗體能夠在大腸桿菌中表達(dá)，并可以通過基因工程進(jìn)行改造（如提高親和性或改變特異性）。目前單鏈抗體被廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究、腫瘤免疫、傳染性疾病檢測(cè)和治療。本研究分析了一株抗TGEV scFv在仔豬TGE的預(yù)防效果，為下一步大規(guī)模臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株與細(xì)胞

TGEV SHXB株和豬精睪丸（ST）細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

Ni-NTA His標(biāo)簽純化試劑盒購(gòu)自美國(guó)Merck公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購(gòu)自Gibco公司；抗His標(biāo)簽小鼠單克隆抗體、HRP標(biāo)記羊抗小鼠二抗購(gòu)自Abcam公司；TMB底物顯色試劑盒購(gòu)自北京天根生物科技公司。

2 方法

2.1 scFv的純化

將攜帶pet28a-scFv質(zhì)粒的大腸桿菌在2×YT培養(yǎng)基上劃線。第2天挑取單個(gè)菌落至卡那霉素抗性液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。使用Ni-NTA His標(biāo)簽純化試劑盒進(jìn)行純化，取少量純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析。

2.2 scFv的特異性分析

取出實(shí)驗(yàn)室保存的TGEV、PEDV、PRRSV、PCV2、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88和K99菌株，37℃包被96孔ELISA板。接著向每孔中加入純化的單鏈抗體100μL，孵育后加入鼠抗His標(biāo)簽一抗，PBST緩沖液洗滌后加入HRP標(biāo)記的抗鼠二抗。最后加入TMB顯色液，在酶標(biāo)儀上讀取OD420nm數(shù)值。

2.3 scFv的空斑實(shí)驗(yàn)

將2×105個(gè)/mL的Vero細(xì)胞接種至六孔板，第2天將感染復(fù)數(shù)（MOI）為1的PEDV與200 μL的scFv共同孵育（1 mg/mL），1小時(shí)后加入細(xì)胞培養(yǎng)六孔板中，孵育1小時(shí)后棄去病毒-scFv混合液，加入低熔點(diǎn)瓊脂糖并培養(yǎng)48小時(shí)。待空斑出現(xiàn)后加入1%結(jié)晶紫溶液染色，記錄空斑數(shù)量。

2.4 scFv對(duì)仔豬腹瀉的保護(hù)實(shí)驗(yàn)

取6頭21日齡長(zhǎng)白仔豬，按以下處理分組：第1組為攻毒組，評(píng)價(jià)病毒的致病性，1頭豬，先灌胃20 mL PBS，1小時(shí)后攻入1.2×106TCID50/mL的TGEV；第2組為scFv預(yù)防組，評(píng)價(jià)scFv的使用效果，3頭豬，先灌胃20 mL濃度為400 μg/mL的scFv，1小時(shí)后攻入1.2×106TCID50/mL的TGEV；第3組為scFv處理組，評(píng)價(jià)scFv的生物安全性，1頭豬，先灌胃20 mL濃度為400 μg/mL的scFv，1小時(shí)后加入20 mL PBS；第4組為陰性對(duì)照組，1頭豬，先灌胃20 mL PBS，1小時(shí)后再灌胃20 mL PBS。在試驗(yàn)的第2、4、7天觀察仔豬發(fā)病情況，記錄精神狀態(tài)、腹瀉情況和死亡數(shù)量。

分別采集發(fā)病死亡的豬以及第7天處死的豬的小腸，解剖并分離空腸、回腸組織，將組織置于10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋后制作切片，HE染色觀察其病理學(xué)變化。

2.5 scFv對(duì)仔豬的生物安全性評(píng)價(jià)

分別在感染后第2、4、7天采集仔豬糞便5 g，加入少量PBS后離心，取上清液。ELISA包被TGEV全病毒抗原5 μg/mL，包被封閉后加入提取的糞便上清液，檢測(cè)糞便中scFv的含量。

3 結(jié)果

3.1 抗豬傳染性胃腸炎病毒scFv的純化

將復(fù)蘇的菌株接種至含有50 μg/mL卡那霉素的2×YT培養(yǎng)基中，待OD600nm達(dá)到0.6時(shí)加入100 mM的IPTG，培養(yǎng)過夜。第2天將菌液離心，收集沉淀，沉淀超聲破碎后，使用Ni-NTA his標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化。10%SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示在28 kDa處有特異性條帶，證實(shí)scFv蛋白獲得了表達(dá)，并成功純化（見圖 1）。

圖1 scFv的SDS-PAGE電泳

3.2 scFv的特異性實(shí)驗(yàn)

將TGEV、PEDV、PRRSV、PSV2、K88和K99病原抗原分別包被ELISA板，檢測(cè)scFv與這些病原的結(jié)合能力。ELISA結(jié)果顯示，TGEV抗原包被孔的OD值大于0.8，其他病毒或細(xì)菌包被孔抗原的OD值小于0.2。將抗原包被孔的OD值／PBS的OD值大于2.5判斷為發(fā)生反應(yīng)，說明scFv能夠與TGEV結(jié)合，并且具有特異性（見圖2）。

圖2 ELISA檢測(cè)scFv特異性結(jié)果

3.3 scFv的空斑實(shí)驗(yàn)

將TGEV和scFv預(yù)先共同孵育1小時(shí)，然后加入細(xì)胞，細(xì)胞上層用低熔點(diǎn)瓊脂糖固定，出現(xiàn)空斑后用結(jié)晶紫進(jìn)行染色。同時(shí)設(shè)立TGEV＋PBS處理組和PBS處理組。圖3是病毒空斑經(jīng)結(jié)晶紫染色后的結(jié)果，圖4是對(duì)圖3中的空斑數(shù)量計(jì)數(shù)結(jié)果。結(jié)果顯示，TGEV＋PBS處理組的平均空斑數(shù)量為167，TGEV+scFv處理組的平均空斑數(shù)量為26，兩組差異顯著，說明scFv具有中和TGEV的作用。

圖3 病毒空斑經(jīng)結(jié)晶紫染色后結(jié)果

圖4 scFv的空斑實(shí)驗(yàn)

3.4 scFv的仔豬保護(hù)實(shí)驗(yàn)

將6頭仔豬分為攻毒組、scFv預(yù)防組、scFv處理組和陰性對(duì)照組。在感染后第2、4、7天觀察臨床癥狀，結(jié)果見表1。從表1可以看出，TGEV攻毒組在第2天開始出現(xiàn)精神沉郁，活動(dòng)減少；第4天開始仔豬出現(xiàn)拉稀，糞便呈現(xiàn)糊狀，肛門周圍有水樣糞便。scFv預(yù)防組仔豬攻毒后第4天糞便松軟；第7天糞便正常，沒有出現(xiàn)拉稀癥狀。scFv處理組和陰性對(duì)照組仔豬觀察期間內(nèi)的糞便正常，沒有腹瀉和精神沉郁等情況。所有組沒有出現(xiàn)仔豬的死亡（見表1）。綜合以上結(jié)果，scFv預(yù)先灌胃后，能夠給仔豬提供保護(hù)，抑制TGEV引起的腹瀉。

采集仔豬的空腸，石蠟包埋后染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGEV攻毒組的仔豬空腸絨毛上皮脫落，隱窩變淺，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。scFv＋TGEV處理組的仔豬腸道與陰性對(duì)照組相同，說明scFv處理能夠?qū)ψ胸i感染TGEV產(chǎn)生保護(hù)（見圖5）。

圖5 HE染色切片結(jié)果

3.5 單鏈抗體的生物安全性評(píng)價(jià)

分別在感染后第2、4、7天采集仔豬糞便加入少量PBS后離心，取上清液。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示單鏈抗體處理組與PBS處理組OD值相同（見圖6）。

圖6 scFv的生物安全性評(píng)價(jià)

表1 仔豬發(fā)病情況

4 討論

TGEV屬于冠狀病毒科，能夠引起仔豬嘔吐、腹瀉和脫水。目前對(duì)TGEV的防治方法為疫苗免疫懷孕母豬，母豬體內(nèi)產(chǎn)生的抗體通過乳汁傳遞給仔豬，從而對(duì)仔豬提供保護(hù)。然而仔豬接近斷奶時(shí)抗體水平下降，容易感染TGEV，此外每頭仔豬吃奶量存在不同，容易導(dǎo)致抗體量吸收不足[5]。之前有研究報(bào)道使用卵黃抗體治療TGEV感染，取得了很好的效果，該研究說明抗體可以用于治療腹瀉性病毒感染。由于卵黃抗體來源于雞，給仔豬使用后可能會(huì)造成免疫反應(yīng)，此外卵黃抗體生產(chǎn)成本高，這也是其難以大規(guī)模應(yīng)用的原因[6]。本文研究了單鏈抗體對(duì)仔豬腹瀉的效果，單鏈抗體僅具有抗體可變區(qū)，避免了使用過程中的種屬差異；此外scFv能夠在大腸桿菌中大量表達(dá)，降低了使用成本。

本研究發(fā)現(xiàn)，將scFv預(yù)先給仔豬灌服再感染TGEV后，仔豬的精神狀態(tài)正常、沒有出現(xiàn)腹瀉，腸道損傷較輕。目前正在進(jìn)行單鏈抗體的納米材料包被工作，該納米材料能夠保護(hù)單鏈抗體免受胃酸的降解。下一步將使用納米材料包被的單鏈抗體進(jìn)行試驗(yàn)，研究包被的scFv是否具有更好的治療效果。

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[4]Bird RE,Hardman KD,Jacobson JW,et al.Single-chain antigen-binding proteins[J].Science,1988,242(4877):423-426.

[5]Yuan X,Lin H,Fan H.Efficacy and immunogenicity of recombinant swinepox virus expressing the A epitope of the TGEV S protein[J].Vaccine,2015,33(32):3900-3906.

[6]Li X,Wang L,Zhen Y,et al.Chicken egg yolk antibodies(IgY)as non-antibiotic production enhancers for use in swine production:a review [J].Journal of Animal Science and Biotechnology,2015,6(1):40.