李福后，王偉霞，劉偉

（1.淮海工學(xué)院海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇連云港222005；2.連云港可為食用菌有限公司，江蘇連云港223500）

金針菇（Flammulina velutipes），又名冬菇、樸菇、毛柄金錢菌，隸屬于傘菌目、口蘑科、金錢菌屬，其肉質(zhì)細(xì)膩，味道宜人，富含精氨酸、賴氨酸等多種必需氨基酸，以及維生素B1、維生素B2、維生素C、維生素PP等[1-3]。金針菇還含有多糖、蛋白聚糖、糖蛋白、倍半萜等多種活性物質(zhì)，具有抗腫瘤、促進(jìn)智力發(fā)育、提高免疫力、預(yù)防和治療肝臟疾病和胃潰瘍等作用，是一種理想的保健食品[4-5]。

近年來，消費(fèi)者對金針菇的需求與日俱增，如何進(jìn)一步提高金針菇的產(chǎn)量和品質(zhì)成為當(dāng)前重要的研究方向。植物激素和殼聚糖作為常見的生長調(diào)節(jié)劑，對食用菌生長發(fā)育具有明顯的影響[6-9]，在液體菌種生產(chǎn)、多糖制備等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值。本文以工廠化栽培菌株為材料，研究不同種類和不同濃度的植物激素、殼聚糖對金針菇菌絲體生長以及胞外多糖產(chǎn)量的影響；以期為植物激素、殼聚糖等生長調(diào)節(jié)劑在液體菌種生產(chǎn)、多糖制備等領(lǐng)域應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：金針菇kw02，由連云港市某食用菌有限公司提供；生長調(diào)節(jié)劑[赤霉素、萘乙酸（naphthylacetic acid，NAA）、 二 氯 苯 氧 乙 酸（Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-D）等激素]：生工生物（上海）股份有限公司，均為分析純；殼聚糖（脫乙酰度≥90%）：連云港澳新生物工程有限公司。

1.2 培養(yǎng)基設(shè)計(jì)

1）固體培養(yǎng)基：以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別加入不同濃度的植物激素。赤霉素使用濃度為0、5、10、15、20 mg/L。NAA 使用濃度為0、2、4、6、10 mg/L。2，4-D 使用濃度為0、5、10、15、30 mg/L。

2）液體培養(yǎng)基：葡萄糖30 g，蛋白胨2 g，酵母粉5g，KH2PO40.5g，MgSO40.5g，，蒸餾水 1000mL。

3）殼聚糖母液制備：參考李輝的方法[10]，配置0.5%殼聚糖溶液，pH 6.0。殼聚糖使用濃度分別為為0、0.025、0.05、0.075、0.1、0.125 mg/mL。

1.3 固體培養(yǎng)方法

利用打孔器從長滿金針菇菌絲體的平板上選取菌種塊，然后接種到添加了植物激素的固體培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)3 d和7d后測量菌落的直徑，計(jì)算菌絲生長速度。

1.4 液體培養(yǎng)方法

種子液的制備：將100 mL液體培養(yǎng)基分裝于250 mL三角瓶，滅菌后備用。利用打孔器從長滿金針菇菌絲體的平板上選取大小約0.5 cm2的菌種塊，接種于三角瓶中，每瓶5塊，25℃，120 r/min，培養(yǎng)5 d。然后利用磁力攪拌器將成團(tuán)的菌塊打碎，繼續(xù)培養(yǎng)3 d后作為種子液使用。

發(fā)酵液的制備：采用100 mL液體培養(yǎng)基，分別加入一定量的植物激素或殼聚糖溶液，以不添加植物激素或殼聚糖溶液的發(fā)酵培養(yǎng)基作為對照，每個處理組設(shè)3次重復(fù)。取種子液接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量5%，然后置于搖床中，25℃，120 r/min，培養(yǎng)7 d。

指標(biāo)測定：發(fā)酵結(jié)束后，10 000 r/min離心5min，上清液用于胞外多糖的測定。沉淀物為菌絲體，蒸餾水沖洗2次后，80℃烘干至恒重，稱量得菌絲體干重。

1.5 胞外多糖的測定

胞外多糖的測定采用蒽酮-硫酸法，在620 nm處測定吸光值[11]。根據(jù)葡萄糖濃度與吸光值的關(guān)系制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為y=0.012 3x+0.058 2，相關(guān)系數(shù)r=0.999 749。取離心后的上清液，首先測定總糖含量，然后加入乙醇至濃度為80%，置于4℃沉降24 h，離心后，測定上清液的還原糖含量，二者之差即為胞外多糖的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 金針菇菌株kw02的菌落特征和菌絲形態(tài)

金針菇菌株kw02的菌落特征和菌絲形態(tài)見圖1。

圖1 金針菇菌株kw02的菌落特征和菌絲形態(tài)Fig.1 Colony characteristics and mycelial morphology of strain kw02

kw02的菌落特征見圖1a，其菌絲潔白、濃密，氣生菌絲發(fā)達(dá)，生長速度快。采用插片培養(yǎng)法，置于光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)（10×40倍），發(fā)現(xiàn)菌絲粗壯，分支多，且鎖狀聯(lián)合較多（圖1b）。

2.2 植物激素對金針菇菌絲體生長的影響

植物激素對金針菇菌絲體生長的影響結(jié)果見圖2。

在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，赤霉素對菌株kw02的菌絲體生長具有促進(jìn)作用，以10 mg/L為最適濃度，菌絲生長速度提高22.7%以上。

低濃度的萘乙酸對菌絲體生長有刺激作用，與對照組相比，4 mg/L和6 mg/L萘乙酸能夠促進(jìn)菌絲生長，菌絲生長速度分別提高2.5%和13.3%，而10 mg/L萘乙酸則抑制菌絲生長。

圖2 植物激素對金針菇菌絲體生長的影響Fig.2 The effect of plant hormones on mycelia growth of Flammulina velutipes

低濃度的2，4-D對菌絲體生長也有促進(jìn)作用，以5 mg/L為最適供試濃度，而30 mg/L 2，4-D則抑制菌絲生長。

2.3 植物激素對金針菇胞外多糖產(chǎn)量的影響

金針菇多糖具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用，而提高多糖產(chǎn)率是金針菇資源開發(fā)的重要方向之一[12]。植物激素對金針菇胞外多糖產(chǎn)量的影響見圖3。

圖3 植物激素對金針菇胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.3 The effect of plant hormones on exopolysaccharide content of Flammulina velutipes

赤霉素對金針菇胞外多糖產(chǎn)量具有明顯的影響，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，胞外多糖產(chǎn)量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，在濃度為5 mg/L時，胞外多糖產(chǎn)量最高，而隨著赤霉素濃度的升高，胞外多糖產(chǎn)量逐漸下降。

萘乙酸對金針菇胞外多糖產(chǎn)量也有明顯的影響，在濃度為4 mg/L時，胞外多糖產(chǎn)量最高，是對照組的2倍多；而萘乙酸濃度大于6 mg/L時，胞外多糖產(chǎn)量迅速下降。

與赤霉素作用類似，2，4-D在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，胞外多糖產(chǎn)量也呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，在濃度為10 mg/L時，胞外多糖產(chǎn)量最高；而隨著激素濃度升高，胞外多糖產(chǎn)量逐漸下降。

2.4 殼聚糖對金針菇菌絲體生長的影響

殼聚糖對金針菇菌絲體生長的影響結(jié)果見圖4。

圖4 殼聚糖對金針菇菌絲體生長的影響Fig.4 The effect of chitosan on mycelia growth of Flammulina velutipes

由圖4可知，適量濃度的殼聚糖有利于菌絲體的生長；與對照組相比，殼聚糖濃度在0.05 mg/mL～0.1 mg/mL范圍內(nèi)，菌絲體生長速度都有明顯的提高，當(dāng)濃度為0.075 mg/mL時，菌絲體生物量最大，比對照組提高34%。當(dāng)濃度超過0.125 mg/mL時，菌絲體生長明顯下降；當(dāng)殼聚糖濃度為0.15 mg/mL時，發(fā)現(xiàn)三角瓶內(nèi)出現(xiàn)了較多的殼聚糖沉淀，這些沉淀可能影響了菌絲體的生長。

2.5 殼聚糖對金針菇胞外多糖產(chǎn)量的影響

殼聚糖對金針菇胞外多糖產(chǎn)量的影響結(jié)果見圖5。

由圖5可知，殼聚糖濃度在0.025 mg/mL～0.075 mg/mL范圍內(nèi)，對金針菇胞外多糖產(chǎn)量基本沒有影響，表明低濃度的殼聚糖雖然能夠促進(jìn)菌絲體生長，但不能促進(jìn)菌絲體分泌胞外多糖。當(dāng)殼聚糖濃度超過0.1 mg/mL時，發(fā)現(xiàn)胞外多糖產(chǎn)量明顯下降，表明高濃度的殼聚糖能夠抑制菌絲體分泌胞外多糖。

圖5 殼聚糖對金針菇胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.5 The effect of chitosan on exopolysaccharide content of Flammulina velutipes

3 討論

植物激素作為痕量信號分子，能夠調(diào)控植物的生長發(fā)育過程和環(huán)境應(yīng)答過程，為農(nóng)作物的化學(xué)控制、農(nóng)業(yè)的發(fā)展做出了重要貢獻(xiàn)[13-17]。研究表明，許多植物激素也能夠調(diào)控食用菌子實(shí)體的生長發(fā)育，在食用菌栽培領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值[18-20]。

不同菌種和同一菌種不同菌株對激素處理的表現(xiàn)具有明顯不同，以赤霉素處理為例，王謙等發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基中赤霉素濃度為1.0 mg/L，金福菇菌絲生長速度最快[21]；侯集瑞等發(fā)現(xiàn)5 mg/L赤霉素最能促進(jìn)羊肚菌菌絲生長[22]；王言等發(fā)現(xiàn)0.005%濃度赤霉素（50 mg/L）對金針菇G1的促生長效果最顯著，而赤霉素對金針菇F29未表現(xiàn)出促生長作用（高濃度時表現(xiàn)抑制作用）[6]；我們發(fā)現(xiàn)，10 mg/L赤霉素最能促進(jìn)金針菇kw02的菌絲生長。

植物激素對食用菌胞外多糖產(chǎn)量也有一定的影響，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，我們發(fā)現(xiàn)低濃度的植物激素有利于菌絲體分泌胞外多糖，表明植物激素可能能夠改變細(xì)胞膜的通透性。

殼聚糖作為一種植物生長調(diào)節(jié)劑，能調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育，提高抗性，研究表明，殼聚糖能夠在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，從而增加產(chǎn)量和提高品質(zhì)[23-24]。殼聚糖對食用菌可能具有類似的作用，通過在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)控基因表達(dá)，從而調(diào)節(jié)菌絲體的生長發(fā)育過程。

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