陳川林 ，杜愛(ài)芳

（1.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)院，浙江 杭州 310058；2.杭州佑本動(dòng)物疫苗有限公司，浙江 杭州 310018）

豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）是引起豬圓環(huán)病毒?。≒CVD）的主要病原。豬圓環(huán)病毒病是世界各國(guó)公認(rèn)的危害養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病，與“豬瘟”和“藍(lán)耳病”統(tǒng)稱為養(yǎng)豬業(yè)的“三座大山”，對(duì)豬群影響較大。防控豬圓環(huán)病毒病最有效的方法是疫苗免疫。目前國(guó)內(nèi)已經(jīng)生產(chǎn)的豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗有豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗SH株、豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗LG株和豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗DBN-SH07株，但是其效價(jià)都不是很高。通常PCV2在PK15細(xì)胞上的TCID50一般在104～105。

本實(shí)驗(yàn)利用豬圓環(huán)病毒2型優(yōu)勢(shì)株（PCV2-ZJ/C株，其毒價(jià)可達(dá)到106.0TCID50/0.1mL），在PK15-ZJU細(xì)胞上增殖條件的優(yōu)化，以摸索適合豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗（ZJ/C株）生產(chǎn)的工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與毒株

PK15-ZJU細(xì)胞與PCV2-ZJ/C株，均來(lái)自農(nóng)業(yè)部動(dòng)物病毒學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑

DMEM干粉，Gibco公司產(chǎn)品；胰蛋白酶，Sigma公司產(chǎn)品；新生牛血清，Hyclone公司產(chǎn)品；D-氨基葡萄糖，Sigma公司產(chǎn)品；其它試劑均為分析純。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

PH計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；水浴鍋 DK-80，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱，日本SANYO公司產(chǎn)品；熒光顯微鏡，日本尼康公司產(chǎn)品；電子天秤，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品。

1.2 方 法

1.2.1 細(xì)胞制備

從液氮罐取出PK15-ZJU細(xì)胞置37℃水浴快速融化，加入含8%新生牛血清的DMEM細(xì)胞生長(zhǎng)液，置37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待其生長(zhǎng)成單層細(xì)胞，加入0.02%EDTA-0.05%胰蛋白酶消化液，在37℃下作用5～8min，加入細(xì)胞生長(zhǎng)液制成細(xì)胞懸液，分裝于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃、12轉(zhuǎn)/h培養(yǎng)，一般48h即可形成細(xì)胞單層。

1.2.2 毒種復(fù)壯

取毒種（PCV2-ZJ/C株）按細(xì)胞培養(yǎng)液1%的量接種到新消化的PK15-ZJU細(xì)胞懸液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h，-20℃凍融3次，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，測(cè)TCID50。

1.2.3 最佳細(xì)胞接種密度確定

將消化、分散后的 PK15-ZJU細(xì)胞密度分別調(diào)整為1.5×105、2.0×105、2.5×105、3.0×105和 3.5×105個(gè) /mL 5個(gè)濃度，每個(gè)濃度3個(gè)轉(zhuǎn)瓶，同步接種1%的PCV2-ZJ/C病毒液（毒種滴度為106.4TCID50/0.1mL），37℃、12轉(zhuǎn)/h培養(yǎng)48h，換含3%血清的維持液，繼續(xù)培養(yǎng)36h收獲病毒液，-20℃凍融3次，測(cè)TCID50，以確定適合病毒增殖的最佳細(xì)胞接種密度。

1.2.4 不同接毒方法與病毒增殖的關(guān)

按表1中4種方法接毒，收獲病毒液后于-20℃凍融3次，測(cè)TCID50，以確定適合病毒增殖的最佳接毒方法（接毒比例為1%，D-氨基葡萄糖為300mmol/L）。

表1 不同接毒方法

1.2.5 收獲時(shí)間與接毒量的確定

將長(zhǎng)成單層的 PK15-ZJU細(xì)胞用消化液消化后，制成2.5×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，分別同步接種1%、2%和3%的PCV2-ZJ/C(種毒效價(jià)為 106.4TCID50/0.1mL)各 5 瓶，37℃、12轉(zhuǎn)/h培養(yǎng)24h，棄去營(yíng)養(yǎng)液，加PBS清洗一遍后加300mmol/L的D-氨基葡萄糖作用30min，棄去D-氨基葡萄糖加含3%血清的維持液繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)72h后每6h取一瓶，-20℃凍融3次，測(cè)病毒滴度。

1.2.6 凍融次數(shù)確定

按之前試驗(yàn)得出的結(jié)果進(jìn)行病毒的培養(yǎng)，收獲病毒液后，分別在-20℃條件下凍融1、2、3、4次，然后分別測(cè)定病毒TCID50，以其中TCID50最高者為病毒的最佳凍融次數(shù)。

1.2.7 收獲毒液的病毒含量（TCID50）測(cè)定

取病毒液用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液做10倍系列稀釋，從10-4～10-9，共6個(gè)稀釋度，分別將稀釋好的病毒液等體積加入到每孔含有100μL PK15-ZJU細(xì)胞懸液的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。每個(gè)稀釋度接種6孔，同時(shí)設(shè)PCV2-ZJ/C株陽(yáng)性細(xì)胞對(duì)照4孔和空白細(xì)胞對(duì)照4孔。接種后放置37℃，含5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h。棄去培養(yǎng)液，將培養(yǎng)的細(xì)胞用冷甲醇-丙酮液固定后，與鼠源抗PCV2衣殼蛋白單克隆抗體反應(yīng)，然后與FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG反應(yīng)，最后用倒置熒光顯微鏡觀察每個(gè)稀釋度的PCV2陽(yáng)性細(xì)胞（熒光顯微鏡下產(chǎn)生綠色熒光）。根據(jù)每個(gè)稀釋度的陽(yáng)性細(xì)胞孔數(shù)，按Reed-Muench方法計(jì)算病毒的TCID50。

2 結(jié)果

2.1 最佳細(xì)胞接種密度確定

從圖1可以看出細(xì)胞接種密度為2.5×105個(gè)/mL時(shí)，病毒滴度最高。細(xì)胞接種密度為3.5×105時(shí)，病毒滴度最低。因此，取最佳細(xì)胞接種密度為2.5×105個(gè)/mL。

圖1 細(xì)胞接種密度對(duì)病毒增殖的影響

2.2 接毒方法的確定

從圖2可以看出采用同步接毒加D-氨基葡萄糖處理的方法接毒，病毒滴度最高，達(dá)到106.36TCID50/0.1mL；其次為同步接毒不加D-氨基葡萄糖處理；分步接毒不加D-氨基葡萄糖處理的病毒滴度最低。因此，確定最佳的接毒方法為同步接毒加D-氨基葡萄糖處理。

圖2 不同接毒方法對(duì)病毒增殖的關(guān)系

2.3 最佳接毒量與收獲時(shí)間的確定

從表2可以看出接毒量為2%，病毒感染90h后收毒獲得到了病毒的最高滴度106.84TCID50/0.1mL。接毒量為1%和2%時(shí)，病毒的滴度都是先隨時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，在90h達(dá)到了最高值，而后隨時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。接毒量為3%時(shí)，病毒的滴度也是先隨時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，但是最高值出現(xiàn)在84h，而后隨時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。所以PCV2-ZJ/C增殖的最佳接毒量為2%，最佳收獲時(shí)間為90h。

表2 不同接毒量及收獲時(shí)間時(shí)的病毒滴度

2.4 最佳凍融次數(shù)的確定

圖3 凍融次數(shù)與病毒滴度的關(guān)系

從圖3可以看出凍融2次時(shí)，病毒的滴度最高，為106.60TCID50/0.1mL。因此取凍融2次為最佳凍融次數(shù)。

3 討論

在體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞中增殖病毒，細(xì)胞接種密度對(duì)病毒的增殖有影響。主要是通過(guò)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)來(lái)影響病毒的增殖。細(xì)胞接種密度過(guò)低，導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)液pH升高變堿，抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，甚至引起細(xì)胞死亡。細(xì)胞接種密度過(guò)高，導(dǎo)致單個(gè)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)成分不足，及細(xì)胞間相互競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)成分，也會(huì)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。所以合適的細(xì)胞接種密度才可以促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而促進(jìn)病毒的增殖。

從本實(shí)驗(yàn)看采用同步接毒的方法病毒滴度高于分步接毒，可能是因?yàn)镻CV2的繁殖要利用PK15細(xì)胞復(fù)制S期的蛋白。此外研究表明，D-氨基葡萄糖一方面可以增強(qiáng)PK15細(xì)胞S期蛋白的表達(dá)，另一方面可以促進(jìn)病毒的DNA進(jìn)入細(xì)胞核，從而增強(qiáng)病毒的增殖，Tischer等最先用D-氨基葡萄糖來(lái)提高PCV2的增殖，此后D-氨基葡萄糖普遍用于PCV2的接毒感染實(shí)驗(yàn)。Gilpin等用300 mM的D-氨基葡萄糖刺激能夠顯著增加病毒的增殖能力。本試驗(yàn)通過(guò)添加D-氨基葡萄糖處理接毒的PK15細(xì)胞，使得PCV2的滴度升高了。

接毒量和收獲時(shí)間也會(huì)影響病毒的滴度，合適的接毒量才可以獲得高滴度的病毒。接毒量低，病毒滴度達(dá)到高峰的時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞狀態(tài)下降，不利于病毒的增殖；接毒量高，病毒間的自我干擾作用，也不利于病毒的增殖。掌握好收毒的時(shí)間也是獲得高滴度病毒的關(guān)鍵，因?yàn)槭斩咎纾《静荒艹浞衷鲋?，而收毒太晚，部分從?xì)胞中釋放出來(lái)的病毒在37℃環(huán)境中死亡。凍融次數(shù)也會(huì)影響病毒的滴度，這是因?yàn)閮鋈诖螖?shù)過(guò)多，會(huì)損傷病毒，降低病毒的活力。凍融次數(shù)少，不能使病毒完全從細(xì)胞中釋放。

PCV2-ZJ/C株從本實(shí)驗(yàn)來(lái)看其滴度可以達(dá)到106.84TCID50/0.1 mL，符合國(guó)家規(guī)程要求每mL病毒含量應(yīng)大于等于106.30TCID50的標(biāo)準(zhǔn)。而且，抗原滴度的提高，極大地提高了同劑量疫苗中抗原的含量，對(duì)免疫效果的增強(qiáng)具有重要的意義。

在轉(zhuǎn)瓶上通過(guò)對(duì)PCV2-ZJ/C株在PK15-ZJU細(xì)胞上增殖條件的優(yōu)化，試驗(yàn)結(jié)果表明，采用同步接毒加D-氨基葡萄糖處理的方法接毒，細(xì)胞接種密度為2.5×105個(gè)/mL，接毒量為2%，接毒后90h收獲，-20℃凍融2次的條件下，PCV2-ZJ/C株增殖效果最好。這為豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗（ZJ/C株）的規(guī)?；a(chǎn)提供了參考依據(jù)。

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