鄒燕娣 包李林 熊巍林 周青燕 林俞霞

(道道全糧油股份有限公司;國(guó)家油菜籽加工技術(shù)研發(fā)分中心，岳陽 414000)

植物甾醇是一種三萜醇類化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與膽固醇非常相似，僅側(cè)鏈結(jié)構(gòu)不同，是一種天然的活性成分，具有十分重要的生理功能，如降膽固醇濃度、抗癌作用、基體抗氧化、預(yù)防心腦血管、免疫調(diào)節(jié)等特點(diǎn)[1-5]，廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥和化妝品行業(yè)。植物甾醇廣泛存在于植物的根、莖、葉、花、果實(shí)和種子中[6]，在所有來源于植物種子的油脂中都含有甾醇，主要包括菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇等，具有開發(fā)利用價(jià)值。植物油是人類膳食甾醇的主要來源，其提供的植物甾醇占膳食總攝入量40%。因此測(cè)定植物油中甾醇含量很有意義。目前植物油中甾醇含量的測(cè)定方法主要有薄層色譜法(TLC)[7]、氣相色譜法(GC)[8-10]和高效液相色譜法(HPLC)[11-13]等，其中氣相分析色譜法分離效果好、分析速度快、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便。本文借鑒GB/T 25223—2010《動(dòng)植物油脂甾醇組成和甾醇總量的測(cè)定氣相色譜法》[14]進(jìn)行植物油中甾醇含量測(cè)定，并對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)，使得檢測(cè)方法更簡(jiǎn)單，檢測(cè)線更低，結(jié)果更準(zhǔn)確。

1 材料與方法

1.1 儀器

7890B型安捷倫氣相色譜儀，HP-5色譜柱；檢測(cè)器：FID；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋；玻璃層析柱：長(zhǎng)47 cm，內(nèi)徑1.0 cm；R201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：附真空泵和水浴鍋；10 cm×10 cm普通硅膠薄層板；碘單質(zhì)；玻璃展開槽：合適10 cm×20 cm薄層板的使用；展開劑∶V(正己烷)∶V(乙醚)=50∶50。

1.2 試劑

甾醇標(biāo)準(zhǔn)品(膽甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、谷甾醇、豆甾醇)：純度≥95%；膽固醇：純度≥99%；豆甾醇標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥95%；正庚烷：色譜純；乙醇：分析純；乙醚：色譜純(重蒸)；氧化鋁：分析純(60～200目，層析專用)；Ⅰ級(jí)氧化鋁：氧化鋁置于450 ℃下煅燒12 h，室溫下黑暗靜止12 h；1.2 mol/L KOH-乙醇溶液；33.6 g KOH溶于100 mL超純水中，用乙醇定容至500 mL；1.0 mg/mL膽固醇內(nèi)標(biāo)溶液：準(zhǔn)確稱取0.1 g(精確至0.000 1 g)膽固醇于100 mL容量瓶中，加入正庚烷溶解并定容。豆甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅰ：稱取豆甾醇標(biāo)準(zhǔn)品0.021 4 g(精確至0.000 1 g)于燒瓶中，精確量取10 mL膽固醇內(nèi)標(biāo)溶液，加熱回流15 min，冷卻至常溫。0.471 8 mg/mL豆甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅱ:準(zhǔn)確稱取一定量的豆甾醇(精確至0.000 1 g)于25 mL容量瓶中，用適量正庚烷溶解并定容，并準(zhǔn)確量取1 mL豆甾醇標(biāo)液和1 mL 1.0 mg/mL膽固醇內(nèi)標(biāo)溶液混勻，上機(jī)測(cè)定豆甾醇和膽固醇的峰面積，采用內(nèi)標(biāo)物的濃度來反測(cè)豆甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅱ的濃度，即得濃度為0.471 8 mg/mL。

1.3 儀器分析條件

色譜柱溫度：270 ℃；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；檢測(cè)器溫度：290 ℃；氮?dú)夂土魉伲?0 mL/min，分流比：20∶1。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

本實(shí)驗(yàn)方法參照 GB/T 25223—2010《動(dòng)植物油脂甾醇組成和甾醇總量的測(cè)定氣相色譜法》。

1.4.1 皂化：稱取0.25 g(精確至0.00 01 g)的油樣于平底燒瓶中，加入1 mL 1 mg/L的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻，加入5 mL 1.2 mol/L氫氧化鉀-乙醇溶液，混勻，置于70 ℃水浴鍋中攪拌皂化至溶液澄清透明(約15 min)。

1.4.2 氧化鋁層析提取不皂化物：向?qū)游鲋谷?0 mL乙醇，并稱取10 gⅠ級(jí)氧化鋁分次倒入層析柱中，再用10 mL乙醇將層析柱中的氧化鋁洗入層析柱中。用5 mL乙醇稀釋皂化液，并移取5 mL皂化液，到裝好的層析柱中，用250 mL平底燒瓶收集流出液，流速為2 mL/min，待皂化液流完后，加入5 mL乙醇洗脫，待流盡，加入30 mL乙醚繼續(xù)洗脫。將收集的洗脫液旋轉(zhuǎn)濃縮至干，用少量乙醚溶解平底燒瓶的目標(biāo)物。此樣品稱為層析樣品。

1.4.3 薄層色譜分離甾醇：將氧化鋁層析后提取的不皂化物乙醚溶液，用平頭微量注射器吸取溶液(共200 μL)點(diǎn)在薄層板下邊緣2 cm處，樣液點(diǎn)成圓點(diǎn)，但直徑不超過3 mm，圓點(diǎn)兩端距離邊緣至少留出3 cm間隙。吸取50 μL膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液在距離邊緣1.5 cm處，左右各點(diǎn)一點(diǎn)。在展開槽中加入大約100 mL展開劑。將板放入展開槽中展開，直到溶劑到達(dá)上邊緣。取出薄層板，在通風(fēng)廚中揮干溶劑，而后將薄層板放入含有碘單質(zhì)的燒杯中，用蓋子蓋好，用吹風(fēng)機(jī)加熱加快碘單質(zhì)揮發(fā)，待薄層板中的物質(zhì)完全顯色后，用鉛筆快速標(biāo)記出所需要的甾醇范圍，用刀片刮下標(biāo)記的硅膠層，并收集到已準(zhǔn)備過濾的濾紙上，加入0.5 mL乙醇，5 mL乙醚對(duì)硅膠洗提3次，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將乙醚提取物濃縮至干，用1～2 mL正庚烷溶解目標(biāo)物。此樣品稱為薄層樣品。

1.5 結(jié)果計(jì)算

1.5.1 校正系數(shù)的測(cè)定

甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣1 μL，確定各甾醇(膽固醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和谷甾醇)出峰時(shí)間。豆甾醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液Ⅰ進(jìn)樣1 μL，重復(fù)進(jìn)樣3～5針，得到內(nèi)標(biāo)物膽固醇和豆甾醇的峰面積。

校正系數(shù)f的計(jì)算公式：

式中：f為校正系數(shù)；A內(nèi)為膽固醇內(nèi)標(biāo)物的峰面積；A標(biāo)為豆甾醇標(biāo)準(zhǔn)品峰面積；C內(nèi)為內(nèi)標(biāo)溶液膽固醇濃度/mg/mL；m標(biāo)為配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液時(shí)豆甾醇標(biāo)準(zhǔn)品的取用量/mg；0.99為內(nèi)標(biāo)物膽固醇的純度；0.95為標(biāo)準(zhǔn)品豆甾醇的純度。

1.5.2 甾醇含量計(jì)算

式中：P總為甾醇總量/mg/kg；f為校正系數(shù)；0.99為內(nèi)標(biāo)物膽固醇的純度；A甾醇酯為油樣中植物甾醇峰面積之和；m油樣為油樣的取用量/mg；1 000為單位換算系數(shù)。

2 結(jié)果處理與討論

2.1 前處理討論

本實(shí)驗(yàn)在國(guó)標(biāo)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了優(yōu)化，國(guó)標(biāo)中使用價(jià)格較昂貴的膽甾烷醇或樺木醇做內(nèi)標(biāo)物，且沒有做內(nèi)標(biāo)物和主要甾醇的校正實(shí)驗(yàn)，而本實(shí)驗(yàn)因植物油中膽固醇含量很少且便宜而被選做內(nèi)標(biāo)物，并進(jìn)行了校正實(shí)驗(yàn)，使得結(jié)果更準(zhǔn)確。國(guó)標(biāo)前處理一個(gè)樣品大約需要7～8 h，而優(yōu)化后的方法處理一個(gè)樣品則只需要50 min，大大地縮短了時(shí)間，可進(jìn)行大批量樣品處理。

2.2 色譜圖

甾醇標(biāo)準(zhǔn)樣出峰色譜圖如圖1所示。圖1為甾醇標(biāo)準(zhǔn)樣出峰色譜圖，樣品可根據(jù)其出峰時(shí)間確定甾醇種類，膽固醇和豆甾醇出峰色譜圖如圖2所示。圖2為內(nèi)標(biāo)物膽固醇和豆甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅰ的出峰色譜圖，根據(jù)膽固醇和豆甾醇各自的峰面積，利用2.1 中校正系數(shù)計(jì)算公式，得出f=1.106 9。

圖1 甾醇標(biāo)準(zhǔn)樣出峰色譜圖

圖3和圖4分別為玉米油氧化鋁層析后和硅膠薄層后的甾醇出峰色譜圖，很顯然，氧化鋁層析后玉米油中主要的甾醇峰面積明顯大于薄層后的，這跟進(jìn)樣溶液中各甾醇含量有關(guān)，其余沒有什么不同。同時(shí)，國(guó)標(biāo)中的樣品都加入了價(jià)格昂貴的硅烷化試劑，而在本實(shí)驗(yàn)中則不加，不影響樣品中的甾醇含量測(cè)定，因?yàn)楣柰榛噭┲皇瞧鸬教岣邫z測(cè)靈敏度的作用。

圖2 膽固醇和豆甾醇出峰色譜圖

圖3 層析后玉米油甾醇色譜圖

圖4 薄層后玉米油甾醇色譜圖

2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

對(duì)同一菜籽油和玉米油分別按照氧化鋁層析法和硅膠薄層法平行進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，方法重復(fù)性實(shí)驗(yàn)見表1。

表1 方法重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

由表1可知，分別采用氧化鋁層析法和硅膠薄層法分別對(duì)菜籽油和玉米油平行進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，RSD%都在0.012%～3.4%，說明兩種方法的重復(fù)性較好。由表1和“3.2色譜圖”中圖3和圖4圖可見，處理同一油樣，其氧化鋁層析后和硅膠薄層后的甾醇含量變化不大，圖譜中各甾醇分離效果好，除了主要甾醇峰面積大小有差異，其余沒什么不同。這說明樣品皂化液經(jīng)氧化鋁層析后提取的不皂化物中，主要含甾醇，且甾醇種類主要為菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和谷甾醇，其他物質(zhì)并不影響主要甾醇含量的測(cè)定。因此將植物油甾醇檢測(cè)方法進(jìn)行簡(jiǎn)化和優(yōu)化，其步驟為：皂化→氧化鋁層析提取不皂化物→濃縮→上機(jī)檢測(cè)。

2.4 準(zhǔn)確性實(shí)驗(yàn)

以菜籽油為本底，向其加入一定量的豆甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅱ，按照優(yōu)化后的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，方法加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)見表2。

表2 方法加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

由表2可知，豆甾醇加標(biāo)回收率在94.0 7%～104%。由此可證明，本實(shí)驗(yàn)方法對(duì)測(cè)定植物油中甾醇含量具有較好的準(zhǔn)確性。

3 結(jié)論

本研究通過參照GB/T 25223—2010方法進(jìn)行植物油中甾醇含量的測(cè)定，通過比較氧化鋁層析后和硅膠薄層后的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)可知，同一樣品經(jīng)氧化鋁層析后和硅膠薄層分離后的甾醇含量變化很小，其實(shí)驗(yàn)重復(fù)性RSD為0.012%～3.4%。故將GB/T 25223—2010方法的前處理進(jìn)行了簡(jiǎn)化和優(yōu)化，不但大大縮短了時(shí)間，而且豆甾醇加標(biāo)實(shí)驗(yàn)回收率為94.07%～104%；說明優(yōu)化后的方法快速、準(zhǔn)確。

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