劉 娟 陳廣鳳 田紀春 吳 澎 趙子彤 楊 藝 李向陽 唐曉珍

(山東省高校食品加工技術與質量控制重點實驗室；山東農(nóng)業(yè)大學食品學院1，泰安 271018) (德州學院生態(tài)與景觀學院2，德州 253023) (山東農(nóng)業(yè)大學小麥品質育種研究室；山東省作物生物學重點實驗室3，泰安 271018)

饅頭的比容和質構性狀作為影響?zhàn)z頭感官品質和市場銷售的重要指標，一直以來都是饅頭加工或品質改良研究的熱點領域，目前對于饅頭比容和質構的研究多傾向于原料、添加劑以及小麥顆粒度等方面[1-6]，對加工技術的研究多于基礎研究。小麥是異源六倍體作物，因而對其基因的研究相較于玉米[7]、水稻[8]等較晚，但近幾年檢測手段的進步，使得對小麥農(nóng)藝性狀及品質性狀的的基因研究日趨完善，但對小麥類產(chǎn)品如饅頭、面條等感官性狀的基因研究尚鮮見報道。

隨著當前單核苷酸多態(tài)性(SNP)標記研究的快速發(fā)展，以及測序技術和基因芯片技術的發(fā)展，自動化程度更高的第3代SNP標記已迅速取代SSR、RFLP等傳統(tǒng)標記，成為最具有發(fā)展?jié)摿Φ姆肿訕擞沎9]。SNP標記遺傳穩(wěn)定、數(shù)量多、分布廣且易于檢測的特點使其能滿足全基因組關聯(lián)分析對大樣本、高密度標記的要求，適合于數(shù)量龐大的檢測分析，可極大的提高關聯(lián)分析的效力[10-11]，現(xiàn)已廣泛應用于小麥遺傳連鎖圖譜的構建[12-14]、分子標記輔助育種[15-17]、遺傳分析和物種進化等研究方面[18-20]。本研究以205份不同小麥品種為實驗材料，通過全基因組關聯(lián)分析以求找到與饅頭比容和質構緊密關聯(lián)的SNP標記，為從分子層面研究饅頭品質性狀提供有價值的參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與表型鑒定

205份不同小麥品種，其中203份來自于中國10個種植冬小麥的省份，包括山東138份、河南24份、河北14份、安徽8份、江蘇6份、北京5份、陜西4份、甘肅2份、貴州與寧夏分別1份；剩余2份分別來自法國與墨西哥。其中，骨干親本132份，高代品系73份，高代品系均來源于山東省。

在2014年和2015年間分別將實驗材料種植于山東泰安(山東農(nóng)業(yè)大學)和山東德州(德州市農(nóng)業(yè)科學院)，播種時每份材料播種3行，行長2 m，行間距0.25 m，均勻播種70粒。在小麥生長期間，對其進行常規(guī)的田間管理，沒有出現(xiàn)嚴重的病蟲害及倒伏現(xiàn)象。待小麥成熟后將其進行收割、標記并研磨成粉。饅頭的制作參考周素梅等[21]的方法并略做改進。待饅頭冷卻后開始測量饅頭的質量、體積與質構。饅頭的體積采用菜籽置換法測量，體積與質量之比即為比容[22]；體積測量結束后，用切割機將饅頭沿豎直方向平行切割成3片，取中間片于質構儀上，在TPA模式下采用P35探頭進行壓縮實驗[23]，測試前速率3.00 mm/s，測試速率1.0 mm/s，測試后速率1.0 mm/s，下壓程度50%。第一次壓縮結束后，探頭回到起始位置，等待3 s后進行第二次壓縮。并采用SPSS 18.0軟件統(tǒng)計分析所得數(shù)據(jù)。

1.2 DNA提取和90K SNP芯片分型

根據(jù)稍作改動的Triticarte(http://www.triticarte.com.au)方法提取小麥幼葉中DNA，并用0.8%的瓊脂糖電泳對提取到的DNA進行濃度與質量的檢測。委托加利弗尼亞大學生物技術檢測中心，使用最新開發(fā)的90K基因芯片(含81 587個SNP)對實驗材料DNA進行分型，并利用Genome Studio軟件對分型結果進行讀取及保存。為確保得到的基因數(shù)據(jù)的質量，用PLINK v1.07對基因數(shù)據(jù)進行處理[24]，選取檢出率大于0.8和低頻基因頻率大于0.05的SNP標記，最終得到24 355個SNP用于饅頭比容和質構關聯(lián)分析。

在參照Wang等[25]整合的遺傳圖譜的基礎上，得到本實驗群體的SNP復合遺傳圖譜信息(表1)。

1.3 性狀與標記間的關聯(lián)分析

運用TASSEL 3.0軟件中的MLM模型對饅頭比容及質構性狀與標記之間進行關聯(lián)分析，當結果中關聯(lián)標記的P<0.001時，認為該標記與目標性狀存在顯著關聯(lián)；P<0.000 1時，認為標記與目標性狀存在極顯著關聯(lián)，當標記在2個及以上環(huán)境中同時被檢測到則認為其是目標性狀相對穩(wěn)定的關聯(lián)位點。

2 結果與分析

2.1 比容與質構性狀表型變異分析

4個環(huán)境下，小麥粉饅頭比容與質構表型數(shù)據(jù)如表2所示。各性狀均有較大的變異系數(shù)，表2中，E4環(huán)境下饅頭比容性狀的變異系數(shù)最大(19.54%)，E1環(huán)境下變異系數(shù)最小(8.45%)；表3中，E1環(huán)境黏著性變異系數(shù)最大(58.50%)，彈性變異系數(shù)最小(3.21%)。除個別環(huán)境外，各性狀的偏度和峰度的絕對值大部分都小于1，符合正態(tài)分布，表現(xiàn)為數(shù)量性狀遺傳，適合進行關聯(lián)分析。

表1 SNP復合遺傳圖譜信息

表2 四個環(huán)境下饅頭比容、質構在群體中的表型數(shù)據(jù)

表2(續(xù))

注：E1：2014年泰安點；E2：2014年德州點；E3：2015年泰安點；E4：2015年德州點，余同。

表3 四個環(huán)境中與饅頭比容、質構性狀相關的極顯著(P<0.000 1)、高貢獻率和穩(wěn)定位點

表3(續(xù))

2.2 SNP標記與饅頭比容、質構相關性狀的關聯(lián)分析

通過對4個環(huán)境中小麥粉饅頭性狀與標記間的關聯(lián)分析，共得到42個比容性狀顯著關聯(lián)位點(P<0.001)，分布于小麥21條染色體中的16條，單個位點表型遺傳變異貢獻率為6.57%～18.31%。其中8個極顯著關聯(lián)位點(P<0.000 1)，同時也是高遺傳貢獻率位點(R2>10%)，2個相對穩(wěn)定位點(在2個及以上環(huán)境中表達)，分布于小麥的2A、2B、2D、3A、4B、6B、7A染色體上。位于4B染色體上的極顯著關聯(lián)位點Tdurum_contig4974_355遺傳貢獻率最大，可解釋17.10%的表型變異，但只在E4環(huán)境中檢測到(表3)。

4個環(huán)境下共檢測到313個質構性狀顯著關聯(lián)位點，分布于小麥的17條染色體上，單個位點表型變異貢獻率為5.49%～25.14%。其中31個極顯著(P<0.000 1)關聯(lián)位點，11個相對穩(wěn)定關聯(lián)位點，46個高遺傳貢獻率位點，分布于小麥的15條染色體上(1A、1B、2A、2B、2D、3A、3B、4A、5A、5B、5D、6A、7A、7B和7D)。同時，檢測到5個極顯著位點，如3B染色體上黏聚性關聯(lián)位點Kukri_c13329_800、7B染色體上咀嚼性關聯(lián)位點Tdurum_contig61884_836等，在2個環(huán)境中表達，且貢獻率大于10%，為主效關聯(lián)位點。

3 討論

標記本身的特性決定了其在遺傳連鎖圖譜上的分布密度，進而對其所定位的QTL產(chǎn)生影響，本研究整合的遺傳連鎖圖譜全長3 674.16 cm，標記間平均距離0.15 cm，且標記的數(shù)量遠超過4 000個。因此，該圖譜具有分子標記數(shù)目較多，覆蓋的遺傳距離長，標記間平均距離小等突出特點，且該圖譜的建成將有助于鑒別和挖掘優(yōu)異的遺傳變異位點。在所有的標記中，B染色體組檢測到的標記數(shù)目最多，A染色體組次之，D染色體組標記數(shù)目最少，這可能是由于小麥D染色體組具有相對較高的保守性造成的[26]。

本研究利用SNP標記對饅頭比容和質構相關性狀進行關聯(lián)分析，采用MLM模型，將協(xié)變量(每個品種個體的Q值、親緣關系)納入回歸分析，并設置較高的閾值(P≤0.000 1)來防止因親緣關系和群體分層所引發(fā)的偽關聯(lián)，從而確保實驗結果的可信度。在不同環(huán)境中所得到的位點常會出現(xiàn)不一致的情況，或許是由于環(huán)境的作用，這是多基因控制的數(shù)量性狀的首要特點。有些位點在2個及以上環(huán)境中同時被檢測到，被稱作相對穩(wěn)定的關聯(lián)位點。與SSR標記相比，SNP標記與功能基因的關聯(lián)更加緊密，這是由于SNP標記不僅在小麥基因中有遺傳穩(wěn)定、數(shù)量多等特點，而且有些基因內的SNP會對蛋白質的結構和表達有直接影響[27]。本研究通過關聯(lián)分析得到2個比容性狀相對穩(wěn)定位點，11個質構性狀相對穩(wěn)定位點，如E1、E4環(huán)境中同時檢測到的與比容顯著關聯(lián)的位點tplb0027d07_633,E1、E4個環(huán)境中檢測到的與硬度關聯(lián)的位點BobWhite_c8436_391等，可作為參考應用于小麥分子標記輔助育種。

4 結論

利用分布于小麥全基因組的24 355個SNP位點對205份不同小麥粉饅頭的比容和質構性狀進行全基因組關聯(lián)分析。檢測到42個饅頭比容性狀顯著關聯(lián)位點，其中8個極顯著(P<0.000 1)且高遺傳貢獻位點，2個相對穩(wěn)定關聯(lián)位點，分布于小麥的7條染色體上。檢測到313個饅頭質構性狀顯著關聯(lián)位點，有31個極顯著(P<0.000 1)關聯(lián)位點，11個相對穩(wěn)定關聯(lián)位點，46個高遺傳貢獻率位點(R2>10%)，分布于小麥的15條染色體上。同時，檢測到5個質構性狀主效關聯(lián)位點。本實驗所得到的這些標記對從分子水平深入研究小麥粉的品質性狀具有重要意義，并為小麥分子育種提供參考。

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