張 雯 姚豫桐

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 四川省人民醫(yī)院肝膽胰脾&細(xì)胞移植中心，四川 成都 610072)

超過80%的肝癌患者在確診時(shí)已經(jīng)處于癌癥晚期，治療后5年內(nèi)生存率低于3%〔1，2〕。肝癌易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)是肝癌致死的重要原因，探究肝癌的發(fā)病機(jī)制，尋找有效方法提高肝癌患者的生存期是重中之重〔3〕。叉頭框蛋白(FOX)E1屬于FOX家族的成員，在胚胎發(fā)育、分化等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，研究報(bào)道，F(xiàn)OXE1在基底細(xì)胞癌、甲狀腺癌、皮膚鱗癌等中異常表達(dá)，并且在癌細(xì)胞的發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮決定性作用〔4～6〕。FOXE1在肝癌中表達(dá)異常下調(diào)，而對(duì)于其在肝癌細(xì)胞侵襲和遷移中的作用尚不清楚〔7〕。本實(shí)驗(yàn)對(duì)FOXE1在體外肝癌細(xì)胞侵襲和遷移中的作用進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1材料 肝癌細(xì)胞SMCC7721、HepG2、HCCLM3和正常肝細(xì)胞HL7702購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)；FOXE1 pcDNA3.1購(gòu)自美國(guó)OriGene；FOXE1、β-actin引物均由上海生工合成；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce；電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Amersham Biosceiences；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Biochrom；DMEM購(gòu)自美國(guó)Sigma；FOXE1抗體購(gòu)自美國(guó)Bioworld；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa；qRT-PCR試劑盒購(gòu)自南京Vazyme；Lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó) invitrogen；基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2抗體、神經(jīng)鈣黏素(N-cadherin)抗體、波形蛋白(Vimentin)抗體、上皮鈣黏附素(E-cadherin)抗體購(gòu)自美國(guó)CTS。

1.2qRT-PCR測(cè)定FOXE1在肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞中的表達(dá) 取人肝癌細(xì)胞SMCC7721、HepG2、HCCLM3和人正常肝細(xì)胞HL7702，提取細(xì)胞中的RNA，用核酸蛋白儀分析A260/A280的比值1.8～2.0。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，合成產(chǎn)物保存在-20℃。qRT-PCR測(cè)定FOXE1水平。引物：FOXE1-正義鏈：5′-GACCACGGTGGACTTCTAGCG-3′，F(xiàn)OXE1-反義鏈：5′-CCCTAC-GCTGGCTCACAT-3′。β-actin-正義鏈：5′-TTGTTACAGGAAGTCCCTTGCC-3′，β-actin-反義鏈：5′-ATGCTATCACCTCCCCTGTGTG-3′。以β-actin為內(nèi)參，根據(jù)PCR反應(yīng)曲線得出閾值循環(huán)數(shù)，分析Ct值，用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3Western印跡測(cè)定FOXE1在肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞中的表達(dá) 取人肝癌細(xì)胞SMCC7721、HepG2、HCCLM3和人正常肝細(xì)胞HL7702，在冰上提取細(xì)胞蛋白，步驟參照細(xì)胞蛋白提取試劑盒。用BCA法對(duì)蛋白定量。按照每組40 μg蛋白樣品進(jìn)行蛋白電泳。在上樣前，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合煮沸5 min后，放在冰上備用。30 mA電流電泳，觀察染料進(jìn)入到分離膠和濃縮膠的交界處以后，把電流調(diào)整到20 mA，直到染料進(jìn)入到分離膠的底部以后，將凝膠取出，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜(轉(zhuǎn)膜電泳用250 mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為2 h)、封閉(5%脫脂奶粉，室溫，封閉1 h)。取出膜，與按照1∶800稀釋的FOXE1一抗在4℃過夜以后，再與1∶2 000稀釋的二抗在室溫反應(yīng)2 h。用ECL顯色，曝光后，用Image J分析條帶的灰度值。FOXE1蛋白水平=FOXE1灰度值/β-actin灰度值。

1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 用Lipofectamine2000將FOXE1 pcDNA3.1和空載體pcDNA3.1轉(zhuǎn)染到HCCLM3細(xì)胞中，步驟參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞依次命名為FOXE1組和Vector組，并且以不做轉(zhuǎn)染的細(xì)胞命名為WT組，在轉(zhuǎn)染后的24 h，分別用qRT-PCR和Western印跡測(cè)定各組細(xì)胞中的FOXE1轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平，步驟同上。

1.5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞遷移 WT、FOXE1、Vector組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后，用細(xì)胞培養(yǎng)液把細(xì)胞濃度調(diào)整為每毫升含有1×106個(gè)細(xì)胞，接種到6孔板中，每孔中添加1 ml的細(xì)胞懸液，培養(yǎng)過夜以后，觀察細(xì)胞長(zhǎng)滿底部以后，用無(wú)菌的移液槍槍頭在底部劃出一條細(xì)痕，用PBS把劃下的細(xì)胞去除以后，每孔添加2 ml的細(xì)胞懸浮液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。測(cè)量0 h和24 h細(xì)胞劃痕的寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率。遷移率=100%×(0 h細(xì)胞劃痕的寬度-24 h細(xì)胞劃痕的寬度)/0 h細(xì)胞劃痕的寬度。

1.6Transwell小室測(cè)定細(xì)胞侵襲 WT、FOXE1、Vector細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后用Transwell小室測(cè)定細(xì)胞侵襲能力。用不含血清的培養(yǎng)液把各組細(xì)胞制成單細(xì)胞懸浮液，密度為1×106個(gè)/ml。在侵襲實(shí)驗(yàn)前30 min，用基質(zhì)膠濕化Transwell小室。把上述100 μl細(xì)胞懸浮液加入到Transwell小室的上室，在下室中添加600 μl的含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液。孵育24 h以后，用甲醇固定10 min，結(jié)晶紫染色20 min，在顯微鏡下觀察細(xì)胞侵襲個(gè)數(shù)。

1.7Western印跡測(cè)定MMP-2、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin蛋白水平 WT、FOXE1、Vector細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，Western印跡方法測(cè)定細(xì)胞中MMP-2、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin蛋白水平，步驟同上。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1FOXE1在肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞中的表達(dá) 肝癌細(xì)胞SMCC7721、HepG2、HCCLM3中FOXE1 mRNA和蛋白水平均明顯低于正常肝細(xì)胞HL7702，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HCCLM3細(xì)胞中的FOXE1 mRNA和蛋白水平明顯低于HepG2細(xì)胞和SMCC7721細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。FOXE1在肝癌細(xì)胞中低表達(dá)，且在HCCLM3細(xì)胞中的表達(dá)水平最低，選用HCCLM3細(xì)胞做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖1和表1。

圖1 Western印跡測(cè)定肝癌細(xì)胞SMCC7721、HepG2、HCCLM3和正常肝細(xì)胞HL7702中FOXE1蛋白水平

表1 肝癌細(xì)胞SMCC7721、HepG2、HCCLM3和正常肝細(xì)胞HL7702中FOXE1 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

與HL7702相比：1)P<0.05；與HCCLM3相比：2)P<0.05

2.2FOXE1在轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中的表達(dá) FOXE1組FOXE1 mRNA和蛋白水平均明顯高于WT組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Vector組FOXE1 mRNA和蛋白水平與WT相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。FOXE1過表達(dá)載體可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞中的FOXE1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。見圖2和表2。

圖2 Western印跡測(cè)定轉(zhuǎn)染后的HCCLM3細(xì)胞中FOXE1蛋白水平

表2 各組細(xì)胞中FOXE1 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

與WT相比：1)P<0.05，下表同

2.3FOXE1對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲及遷移影響 FOXE1組細(xì)胞遷移率和侵襲細(xì)胞數(shù)目均明顯低于WT組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Vector組細(xì)胞遷移率和侵襲細(xì)胞數(shù)目與WT組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。FOXE1過表達(dá)載體可以降低肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。見表3。

表3 各組細(xì)胞遷移率和侵襲細(xì)胞數(shù)目比較

2.4FOXE1對(duì)肝癌細(xì)胞中MMP-2、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin蛋白表達(dá)影響 FOXE1組MMP-2、N-cadherin、Vimentin蛋白水平均明顯低于WT組，而E-cadherin水平明顯高于WT組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Vector組MMP-2、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin蛋白水平與WT組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。FOXE1過表達(dá)載體可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)，抑制細(xì)胞中MMP-2、N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)。見圖3和表4。

圖3 Western印跡測(cè)定MMP-2、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin蛋白表達(dá)

表4 各組細(xì)胞中MMP-2、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin蛋白水平比較

3 討 論

叉頭框家族是一個(gè)十分龐大的轉(zhuǎn)錄因子家族，其成員都含有一個(gè)典型的叉頭區(qū)域，該蛋白家族能夠影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化等多種生物學(xué)功能，與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)〔8〕。FOXE1是叉頭框家族成員之一，最初發(fā)現(xiàn)其可以調(diào)控甲狀腺的生長(zhǎng)，是一種重要的甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子，能夠影響甲狀腺濾泡細(xì)胞的生長(zhǎng)〔9〕。研究表明，F(xiàn)OXE1在腫瘤中表達(dá)異常，并且與腫瘤的惡性程度有關(guān)，目前發(fā)現(xiàn)的與FOXE1有關(guān)的惡性腫瘤主要有結(jié)直腸癌、胰腺癌、白血病、大腸癌等〔10～13〕。在大腸癌中提高FOXE1的表達(dá)后，大腸癌細(xì)胞的惡性程度降低，細(xì)胞侵襲能力下降〔13〕。周宇帆〔7〕檢測(cè)了肝癌細(xì)胞中FOXE1 mRNA水平發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXE1 mRNA在肝癌中低表達(dá)，并且其表達(dá)水平的高低與肝癌血管侵犯、包膜侵犯等有關(guān)。

腫瘤轉(zhuǎn)移大致分為4步：首先腫瘤從原發(fā)部位脫落以后穿過基底膜進(jìn)入到間質(zhì)中；其次，腫瘤細(xì)胞通過在間質(zhì)中的移行到達(dá)脈管周圍；第三，腫瘤穿過血管內(nèi)皮組織進(jìn)入到血液中；第四，腫瘤細(xì)胞穿過血管，進(jìn)入到新的組織中，增殖形成新的病灶〔14～16〕。在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤細(xì)胞降解細(xì)胞外基質(zhì)是關(guān)鍵步驟，細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分為Ⅳ型膠原酶，因此，Ⅳ型膠原酶也是阻礙腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要屏障。MMPs是細(xì)胞外基質(zhì)降解的主要蛋白酶，其中MMP-2是目前發(fā)現(xiàn)的降解Ⅳ型膠原酶的主要蛋白酶，其可以打破外基質(zhì)的降解平衡，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞穿過組織屏障向鄰近組織轉(zhuǎn)移〔17，18〕。腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中其上皮細(xì)胞特征逐漸減弱，間質(zhì)細(xì)胞特征逐漸明顯，這被稱之為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，E-cadherin是上皮細(xì)胞的標(biāo)志物，而N-cadherin、Vimentin是間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物，其在肝癌中異常表達(dá)〔19，20〕。

本實(shí)驗(yàn)說明FOXE1在肝癌細(xì)胞中表達(dá)降低，F(xiàn)OXE1可以降低肝癌細(xì)胞降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力，降低肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，抑制肝癌細(xì)胞EMT，F(xiàn)OXE1可能在肝癌中發(fā)揮抑癌基因的作用。

FOXE1在多種腫瘤中異常表達(dá)，并且可以影響腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)特性，而本實(shí)驗(yàn)證明，F(xiàn)OXE1可能作為一種抑癌基因參與肝癌轉(zhuǎn)移，F(xiàn)OXE1可以降低肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，抑制肝癌細(xì)胞EMT，其具體的作用機(jī)制需要在以后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行探討，這對(duì)于今后研究肝癌的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

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