孟慶敏 余 瑩 孔 靜 劉玲伶 田平平 郭 兵 肖 瑛 王圓圓 石明雋

(貴州醫(yī)科大學病理生理學教研室，貴州 貴陽 550004)

糖尿病(DM)腎病(DN)是DM常見而嚴重的并發(fā)癥之一，然而DN的確切發(fā)病機制尚不清楚。腎小管上皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化(EMT)在腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用〔1～3〕。 wnt信號通路是誘導(dǎo)EMT發(fā)生的一條關(guān)鍵信號通路。目前大量的研究表明wnt信號通路的異常激活參與了肺、肝、心臟、皮膚及腎等很多器官纖維化時的EMT過程〔4，5〕。分泌型卷曲相關(guān)蛋白家族(sfrps)因為與wnt信號通路的受體Frizzled的CRD區(qū)域同源而被認為是wnt信號通路的一類拮抗因子。本實驗旨在觀察sfrp-1在DN小鼠腎組織中的表達變化，探討DN時sfrp-1在DN腎纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1主要材料、試劑 鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司；聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜、增強化學發(fā)光法(ECL)顯色劑、蛋白濃度測定試劑盒二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天，蛋白質(zhì)Marker購自北京索萊寶公司；兩步法免疫組化檢測試劑、辣根過氧化物酶標記羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G、辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG均購自北京中杉全橋生物技術(shù)有限公司；β管家基因(β-actin)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌動蛋白(SMA)、膠原蛋白(col-Ⅲ)、wnt4、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、sfrp-1均購自北京博奧森公司；sfrp-1逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為Thermo產(chǎn)品；sfrp-1實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR)試劑盒為北京天根系列產(chǎn)品。

1.2動物模型復(fù)制、分組和標本收集 雄性清潔級昆明小鼠購自貴州醫(yī)科大學動物中心，動物批號：SCXK(黔)2012-0001；昆明小鼠在清潔環(huán)境下給予正常飲食及自由飲水適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，檢測尿蛋白和尿糖定性為陰性；小鼠空腹血糖都在正常范圍(3.2～7.1 mmol/L)內(nèi)。小鼠禁食不禁水3 h，給予55 mg/kg STZ腹腔注射，連續(xù)5 d，1次/d。造模后2 w測小鼠空腹血糖，以血糖≥16.7 mol/L且尿糖陽性者判定為造模成功。正常對照組給予相同劑量STZ溶媒無菌檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射，連續(xù)5 d，1次/d。小鼠均給予標準飼料喂養(yǎng)，自由飲水。 12只小鼠隨機分為DM組(n=6)、正常對照組(n=6)。兩組分別于成模后10 w處死。小鼠處死前1 d用小鼠代謝籠收集24 h尿。處死前禁食不禁水6 h，稱體重，測空腹血糖，水合氯醛麻醉后摘眼球取血，開腹取胰腺組織和雙側(cè)腎臟，胰腺和一側(cè)腎臟固定于4%中性甲醛，另一側(cè)腎臟保存于-80℃。

1.3免疫組化法檢測目的蛋白表達 烤片60℃、2 h后，常規(guī)脫蠟水化，3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶、檸檬酸緩沖液微波爐煮沸抗原修復(fù)、曲拉通破膜、磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次后，一抗(β-catenin；1∶100；sfrp-1；1∶100)4℃冰箱濕盒孵育過夜；復(fù)溫30 min，PBS洗3次后，37℃孵育相應(yīng)二抗1 h。PBS洗3次，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯微鏡下染色，流水沖洗，蘇木素鏡下復(fù)染，流水沖洗，常規(guī)脫水透明，晾干，中性樹脂封片干燥后，鏡下觀察蛋白表達。

1.4免疫印跡分析 稱取小鼠50～100 mg腎臟組織，去掉髓質(zhì)，加入按比例配置的含苯甲基磺酰氟(PMSF)的裂解液于勻漿器內(nèi)，冰上研磨，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，按比例加入1.5倍緩沖液配置成蛋白樣品，震蕩混勻，100℃，煮沸10 min，使蛋白充分變性，-20℃保存待用。用前解凍，上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、相應(yīng)一抗4℃冰箱搖床孵育過夜，一抗分別為β-actin(1∶1 000)、wnt4(1∶400)、α-SMA(1∶200)、E-cadherin(1∶200)、sfrp-1(1∶500)、col-Ⅲ(1∶200)、糖原合成酶激酶(GSK)-3β(1∶500)、p-GSK3β(1∶500)、β-catenin(1∶300)。次日，洗膜后，相應(yīng)二抗孵育1 h，洗膜后ECL顯影曝光。檢測各目的蛋白的相對表達量，圖像采用BIO-RAD圖像處理軟件分析。

1.5RNA的提取和RT-PCR分析 按照TRIZOL總RNA試劑盒方法提取小鼠腎皮質(zhì)總RNA，測定RNA純度和濃度。根據(jù)Thremo試劑盒說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，Real-time PCR采用天根試劑盒20 μl體系，具體實驗步驟按照試劑盒說明書進行。數(shù)據(jù)采用BIO-RAD軟件處理分析。

1.6統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1兩組生化指標比較 小鼠造模成功后，逐漸出現(xiàn)多飲、多食、多尿、消瘦，體重明顯減輕；正常對照組無上述癥狀，體重增長明顯。DM組血糖、肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白、三酰甘油水平均明顯高于正常對照組(P<0.05)，見表1。

2.2免疫組化結(jié)果 正常對照組腎組織幾乎沒有β-catenin蛋白的表達，而DM組腎小管上皮細胞胞質(zhì)內(nèi)可見β-catenin蛋白大量集聚，并出現(xiàn)核轉(zhuǎn)移(圖中箭頭所指處)；sfrp1蛋白在正常對照組腎皮質(zhì)腎小管細胞胞質(zhì)內(nèi)可見棕黃色陽性表達，而在DM組陽性表達減少，見圖1。

2.3Western印跡結(jié)果 與正常對照組比較，wnt4、β-catenin、p-GSK3β、α-SMA和col-Ⅲ蛋白在DM組腎皮質(zhì)表達明顯增多(P<0.05)，E-cadherin和sfrp-1蛋白表達顯著減少(P<0.05)，而GSK-3β蛋白表達兩組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2、圖2。

表1 兩組生化指標比較

與正常對照組比較：1)P<0.05；表2同

圖1 兩組腎組織sfrp-1蛋白和β-catenin蛋白表達(×400)

表2 兩組腎組織wnt4、β-catenin、P-GSK3β、GSK-3β、sfrp-1、E-cadherin、α-SMA和col-Ⅲ蛋白表達

圖2 兩組腎組織wnt4、β-catenin、p-GSK3β、GSK3β、sfrp-1、E-cadherin、α-SMA和Col-Ⅲ蛋白表達

2.4Sfrp-1 mRNA表達 與正常對照組(1.1±0.13)比較，DM組腎皮質(zhì)sfrp-1表達顯著降低(0.6±0.08，P<0.05)。

3 討 論

本研究蛋白印跡結(jié)果表明，小鼠腎皮質(zhì)腎小管上皮細胞中，上皮細胞表型標志蛋白E-cadherin表達下調(diào)，而間充質(zhì)細胞表型標志蛋白α-SMA表達上調(diào)，同時伴有細胞外基質(zhì)的主要成分之一col-Ⅲ顯著增多，提示DN小鼠腎小管上皮細胞發(fā)生了EMT。

wnt信號通路是誘導(dǎo)EMT的一條關(guān)鍵信號通路，wnt家族19種成員中wnt4與泌尿系統(tǒng)發(fā)展至關(guān)重要。本研究提示DN小鼠腎臟wnt信號通路被激活。 p-GSK3β蛋白不能使β-catenin發(fā)生磷酸化，未被磷酸化的β-catenin蛋白不能被泛素化降解而在胞質(zhì)中不斷累積后轉(zhuǎn)移入核，結(jié)合核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)下游致纖維化靶基因的表達，從而促進DN小鼠腎臟EMT的發(fā)生。前期的研究結(jié)果也表明wnt4/β-catenin信號通路的異常激活促進了單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)大鼠腎纖維化時腎小管上皮細胞EMT的發(fā)生。與He等〔6〕報道的UUO大鼠模型腎組織中wnt4、col-Ⅲ及α-SMA蛋白高水平表達一致。

有研究證實SFRP-1基因改變或表達下調(diào)是wnt信號通路異常激活的重要原因〔7〕。sfrp-1屬于分泌型糖蛋白家族，定位于染色體8p12～11.1〔8〕，由sfrp基因編碼。sfrp結(jié)構(gòu)上與wnt通路的受體(frizzled，F(xiàn)z)具有同源的CRD區(qū)，能與wnt蛋白相互作用以阻止wnt蛋白結(jié)合至Fz蛋白；或與Fz形成無功能復(fù)合物而阻礙wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。sfrp-1通過抑制wnt信號通路而抑制纖維化進程。本研究結(jié)果提示sfrp-1可能參與了DN小鼠腎纖維化過程，這與Suzuki等〔9〕在大腸癌中建立的人結(jié)腸癌細胞和結(jié)直腸癌裸鼠模型中的研究結(jié)果一致，有研究證實，在培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基中，應(yīng)用sfrp-1蛋白能通過抑制wnt信號通路從而抑制肺成纖維細胞增殖〔10〕。葛文松等〔11〕發(fā)現(xiàn)，sfrp-1阻斷wnt經(jīng)典信號通路可顯著抑制肝星狀細胞(HSC)增殖，促使其凋亡，減少膠原分泌。

總之，DN時wnt信號被激活，而wnt信號通路的抑制因子sfrp-1蛋白和mRNA表達下調(diào)。提示wnt信號通路的的異常激活可能與其抑制因子sfrp-1的表達下調(diào)而導(dǎo)致對wnt信號的抑制作用減弱有關(guān)，進而促進了DN小鼠腎纖維化的發(fā)生發(fā)展。而尋找sfrp-1表達下調(diào)的原因及重新恢復(fù)其表達，進而扭轉(zhuǎn)wnt信號的活化狀態(tài)，為抗DN腎纖維化提供了新方向。

4 參考文獻

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