許官學(xué) 王正龍 趙然尊 龍仙萍 陳文明 石 蓓

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，貴州 遵義 563003)

急性心肌梗死(AMI)是臨床常見的急危重癥，患者易發(fā)生心力衰竭，預(yù)后差，嚴(yán)重影響患者生命質(zhì)量〔1〕。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是一種具有自我增殖和多種分化潛能的干細(xì)胞〔2〕，目前在細(xì)胞治療、組織和器官修復(fù)等方面呈現(xiàn)出巨大優(yōu)勢(shì)。近年來，通過干細(xì)胞移植重建損毀心肌顯示良好的應(yīng)用前景。研究表明，人受體活性修飾蛋白(hRAMP)1基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)可以有效改善梗死后心臟功能及促進(jìn)損傷血管內(nèi)皮修復(fù)〔3〕。本研究主要觀察hRAMP1基因修飾的BMSCs在血管內(nèi)皮細(xì)胞定向分化及其對(duì)心功能的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭大白兔購(gòu)自遵義醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2主要儀器試劑 增強(qiáng)型綠熒光蛋白報(bào)告基因(EGFP)、hRAMP1基因重組腺病毒載體，均由本課題組完成構(gòu)建；胎牛血清(FBS)、L-DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；兔骨髓淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自北京Mairybio，戊巴比妥鈉為美國(guó)Sigma公司；血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子CD29、CD31、CD45、CD90多克隆抗體為英國(guó)Abcam公司；兔血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和核因子(NF)-κB酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海西唐生物科技公司；倒置熒光顯微鏡為日本Nikon Ti-S；流式細(xì)胞儀為BD FACSCalibur。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1BMSCs分離與培養(yǎng) 以3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)對(duì)新西蘭兔進(jìn)行麻醉，無菌條件下抽取骨髓3～4 ml。用等體積磷酸鹽緩沖液(PBS)混勻稀釋，1 000 r/min離心5 min，棄上清及脂肪層，留細(xì)胞懸液。將其緩慢加到等體積兔淋巴細(xì)胞分離液中，2 000 r/min離心18 min，分離、收集單個(gè)核細(xì)胞(BMNCs)。將收集到的BMNCs重復(fù)洗滌2次，以DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代培養(yǎng)。10 d左右，當(dāng)細(xì)胞鋪瓶底滿80%～90%，用0.25%胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液，以一傳二的形式進(jìn)行傳代。后續(xù)正式實(shí)驗(yàn)使用第3～4代細(xì)胞。

1.3.2BMSCs鑒定 應(yīng)用BD流式細(xì)胞儀，以CD29-異硫氰酸熒光素(FITC)、CD45-藻紅蛋白(PE)、CD90-PE熒光染料標(biāo)記的抗體鑒定BMSCs。將1.0×106個(gè)培養(yǎng)BMSCs用PBS制成單細(xì)胞懸液，設(shè)置對(duì)照組、CD29-FITC+CD45-PE組和CD90-PE組；3組相應(yīng)加入兔免疫球蛋白(Ig)G-FITC 10 μl、鼠抗兔CD29-FITC和CD45-PE抗體各10 μl、鼠抗兔CD90-PE抗體10 μl，后置于暗處避光反應(yīng)30 min，1 200 r/min，離心5 min后收集細(xì)胞沉淀。使用無菌1×PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)并分選、計(jì)數(shù)表面陽性標(biāo)記細(xì)胞。

1.3.3腺病毒載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)染 構(gòu)建Ad-EGFP-hRAMP1和Ad-EGFP重組腺病毒載體，并通過RT-PCR、Western印跡及測(cè)序鑒定。取第3代BMSCs，以1×105個(gè)/ml接種6孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，當(dāng)瓶底細(xì)胞密度為70%～80%，更換無血清培養(yǎng)基，參考預(yù)實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染條件，病毒Ad-EGFP-hRAMP1按照復(fù)感染指數(shù)(MOI=800)轉(zhuǎn)染BMSCs。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)6 h，吸棄培養(yǎng)液，PBS洗孔板一次，加入含10%FBS培養(yǎng)基3 ml/孔，繼續(xù)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)24 h、48 h及72 h 3個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)，在熒光倒置顯微鏡下對(duì)轉(zhuǎn)染情況進(jìn)行觀察，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞中綠色熒光染色細(xì)胞數(shù)，觀察并估計(jì)轉(zhuǎn)染效率。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞消化離心，經(jīng)1×PBS沖洗兩遍后制備密度為1×105個(gè)/ml細(xì)胞懸液，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)培養(yǎng)BMSCs的轉(zhuǎn)染率。

1.3.4心肌梗死再灌注模型建立 實(shí)驗(yàn)新西蘭兔按照1 ml/kg量經(jīng)由耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，于胸骨左緣第2～4肋間斷肋，游離肋間組織。暴露心包膜、充分暴露心臟，于左心耳下方5～10 mm處用6.0號(hào)丙烯線予貫穿持續(xù)結(jié)扎左室支90 min，心臟再灌注恢復(fù)后關(guān)閉胸腔。觀察模型建立情況。

1.3.5轉(zhuǎn)染BMSCs和細(xì)胞移植 移植前3 d，按照復(fù)感染指數(shù)(MOI=800)加入Ad-EGFP-hRAMP1和Ad-EGFP重組腺病毒，轉(zhuǎn)染BMSCs。轉(zhuǎn)染3 d后消化BMSCs細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液密度為1.0×108個(gè)/ml，行耳緣靜脈移植，實(shí)驗(yàn)設(shè)置Ad-EGFP-hRAMP1-BMSCs(hRAMP1-BMSCs組)、Ad-EGFP-BMSCs(BMSCs組)和對(duì)照組，每組各6只。

1.3.6ELISA檢測(cè)VEGF和NF-κB 用兔耳緣靜脈血2 ml，室溫3 000 r/min離心10 min分離血清，按照試劑盒操作說明測(cè)定血清VEGF和NF-κB含量。酶標(biāo)儀讀取450 nm處樣品吸光度值(OD)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)VEGF和NF-κB含量。

1.3.7超聲心動(dòng)圖的檢測(cè) BMSCs移植后28 d，心臟超聲檢測(cè)3個(gè)連續(xù)的心動(dòng)周期內(nèi)左心室舒張末徑(LVDd)、左心室收縮末徑(LVSd)、短軸縮短率(LVFS)及左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)，取平均值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1骨髓BMSCs的分離培養(yǎng)、鑒定及細(xì)胞轉(zhuǎn)染 骨髓細(xì)胞分離24 h后開始貼壁，由開始多角形或長(zhǎng)梭形逐漸變成穩(wěn)定長(zhǎng)梭形，導(dǎo)致顯微鏡下視野呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞外觀。EGFP標(biāo)記的重組腺病毒載體成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，在倒置熒光顯微鏡視野下可見綠色熒光。Ad-EGFP-hRAMP1和Ad-EGFP在轉(zhuǎn)染BMSCs 72 h后，有大約80%細(xì)胞可觀察到綠色熒光。見圖1。

圖1 BMSCs原代培養(yǎng)及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記CD29、CD45和CD90，結(jié)果顯示，有95.79% 呈現(xiàn)出CD29陽性表達(dá)，12.49% 有CD45陽性表達(dá)，而有98.58%出現(xiàn)CD90陽性表達(dá)。

2.2建立新西蘭兔心肌梗死模型評(píng)價(jià) 實(shí)驗(yàn)新西蘭兔心臟左室支結(jié)扎前，正常心肌顏色紅潤(rùn)，左室支而結(jié)扎90 min后心肌逐漸變?yōu)樯n白色。心電圖測(cè)定顯示，結(jié)扎后與結(jié)扎前相比ST段弓背向上抬高，提示已成功建立心肌缺血再灌注模型。兔心肌梗死模型建立28 d，制備心肌組織切片并進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，可見正常的新西蘭兔心肌纖維排列整齊有序，中央為心肌纖維細(xì)胞核；梗死的新西蘭兔的心肌纖維排列紊亂，細(xì)胞核多數(shù)出現(xiàn)溶解，并見少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)多數(shù)梗死區(qū)膠原纖維演變?yōu)轳：劢M織。見圖2。

圖2 新西蘭兔心肌梗死模型評(píng)價(jià)

2.3移植BMSCs向損傷血管歸巢并分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞 以心肌缺血再灌注實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型手術(shù)損傷側(cè)血管和未損傷側(cè)血管作比較，發(fā)現(xiàn)BMSCs移植后損傷側(cè)血管腔面可觀察到綠色熒光標(biāo)記，而對(duì)側(cè)未損傷血管則無綠色熒光出現(xiàn)。經(jīng)過TRITC標(biāo)記的CD31表達(dá)處會(huì)呈現(xiàn)出紅色熒光。與冰凍切片同一視野比較發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組增生內(nèi)膜中無CD31和EGFP的表達(dá)；血管增生內(nèi)膜有CD31和EGFP表達(dá)，結(jié)果提示，重組腺病毒載體成功轉(zhuǎn)染至BMSCs內(nèi)，結(jié)合到損傷部位后定向分化促進(jìn)血管內(nèi)皮的生成。見圖3。

A、C：hRAMP1-BMSCs組，B、D：對(duì)照組圖3 細(xì)胞移植28 d BMSCs歸巢至損傷的血管并分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞(×400)

2.4VEGF和NF-κB血清學(xué)檢測(cè) 心肌梗死后28 d，與對(duì)照組比較，BMSCs組及hRAMP1-BMSCs組VEGF表達(dá)均顯著增高(P<0.01)，NF-κB水平顯著下降(P<0.01)；與BMSCs組比較，hRAMP1-BMSCs組VEGF表達(dá)顯著增高，NF-κB水平顯著下降(均P<0.01)。見表1。

表1 各組VEGF和NF-κB表達(dá)水平及心臟超聲檢測(cè)結(jié)果比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.01；與BMSCs組比較：2)P<0.01

2.5各組心臟超聲檢測(cè)結(jié)果比較 與對(duì)照組比較BMSCs組LVDd、LVDs均降低，LVFS、LVEF均增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；hRAMP1-BMSCs組LVDd和LVDs均顯著降低(P<0.01)，LVFS和LVEF均顯著增加(P<0.01)。

3 討 論

AMI是冠狀動(dòng)脈閉塞至心肌急性、持續(xù)性缺血缺氧及壞死，常伴有血清心肌酶活性增強(qiáng)并伴有進(jìn)行性心電圖動(dòng)態(tài)變化，甚至可并發(fā)心律失常，引起休克或心力衰竭。盡管經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)能顯著改善AMI患者的預(yù)后，然而PCI術(shù)后患者出現(xiàn)的血管再狹窄，仍是目前面臨的瓶頸，而促進(jìn)損傷血管快速再內(nèi)皮化，防止血管再狹窄是改善AMI心功能的重要策略及環(huán)節(jié)。本課題組前期研究表明，單純BMSCs移植一定程度上能夠通過自身的分化為內(nèi)皮細(xì)胞或通過旁分泌機(jī)制促進(jìn)損傷動(dòng)脈的內(nèi)皮修復(fù)，降低血管再狹窄風(fēng)險(xiǎn)，但效果并不十分理想〔4〕。降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)是生物學(xué)方法發(fā)現(xiàn)的第一種活性多肽，由37 個(gè)氨基酸組成，與其受體結(jié)合后，可通過升高腺苷酸環(huán)化酶(cAMP)，發(fā)揮內(nèi)源性擴(kuò)血管活性〔5，6〕。CGRP受體包含受體活性修飾蛋白(RAMP)-1和降鈣素受體樣受體(CRLR)亞單位。研究顯示，CGRP在心血管系統(tǒng)具有擴(kuò)血管、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、參與血管損傷內(nèi)皮修復(fù)等活性〔7，8〕，而RAMP-1則是CGRP執(zhí)行生物學(xué)功能的關(guān)鍵。研究表明，CGRP與其受體結(jié)合后可抑制梗死區(qū)域局部NF-κB介導(dǎo)趨化性因子的產(chǎn)生〔9〕，其機(jī)制可能為通過BMSCs分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞并參與血管生成。本研究結(jié)果表明，BMSCs移植可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分化并參與兔心肌梗死模型損傷血管生成，有利于缺血組織再血管化。本研究結(jié)果提示，hRAMP1基因修飾的BMSCs移植后可以更好地減輕AMI后由于心室重構(gòu)導(dǎo)致的心功能降低，加強(qiáng)對(duì)延緩或阻止左室重構(gòu)的發(fā)展及對(duì)心功能的保護(hù)作用。基于上述本研究結(jié)果，推測(cè)其機(jī)制可能為，hRAMP1修飾可能增強(qiáng)CGRP活性或調(diào)節(jié)旁分泌效應(yīng)分泌促血管生成因子〔10～12〕，如一氧化氮(NO)、VEGF、NF-κB等，有利于心肌梗死區(qū)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生成及損傷血管內(nèi)皮的修復(fù)，調(diào)節(jié)BMSCs移植后梗死區(qū)域局部微環(huán)境，改善心功能保護(hù)心臟。綜上，本研究顯示，hRAMP1修飾的BMSCs移植后可誘導(dǎo)BMSCs向損傷血管歸巢，并可定向分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，且對(duì)延緩或阻止左室重構(gòu)及心功能保護(hù)具有積極作用。

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